Экологическая роль сульфидогенных бактерий в образовании сульфид

На правах рукописи

Иккерт Ольга Павловна

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУЛЬФИДОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ОБРАЗОВАНИИ СУЛЬФИДОВ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА

03.02.08 – Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Улан-Удэ — 2012

Работа выполнена в Томском государственном университете на кафедре физиологии растений и биотехнологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор

Карначук Ольга Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Намсараев Баир Бадмабазарович

доктор биологических наук,

зав.  лабораторией  биотехнологии

Терещенко Наталья Николаевна

Ведущая организация:Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится «24» декабря 2012 г., в 10:00 часов на заседании Диссертационного совета Д.212.022.03 при ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, конференц-зал. Факс: (3012) 210588, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Бурятский государственный университет» и на сайте www.bsu.ru

Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Загрязнение тяжелыми металлами различных экосистем представляет одну из наиболее серьезных экологических проблем современного общества. В производственных циклах добывающих и выплавляющих металлы предприятий образуются большие количества отходов и стоков, содержащих высокие концентрации растворенных тяжелых металлов или/и сульфата. Примерами таких отходов являются кислые шахтные дренажи (КШД) (Johnson, Hallberg, 2003), сточные воды предприятий по обогащению металлических руд (Barnes et.al., 1991), сточные воды кожевенных заводов (Shin et.al.,1997), фильтраты гипсовых отвалов (Deswaef et.al., 1996). Наиболее распространенные загрязнители в этих экосистемах -Cu, Zn, Cd, As, Ni, и Fe. Их концентрация варьирует от 10-6 до 102 г/л (Huisman, 2006). В частности, среднее количество меди, поступающее в почвы составляет 35 кг/км2 в год. По оценкам 19300 км рек и примерно 72000 Га озер и резервуаров в мире нанесен серьезный ущерб КШД (Johnson, 2005). Сходную проблему представляет шлак от металлургических предприятий, который размещается в хвостохранилищах и на свалках и содержит высокие концентрации (потенциально ценных) тяжелых металлов.

Сульфидогенные микроорганизмы обладают способностью связывать металлы в нерастворимые сульфиды и являются основными агентами, обеспечивающими естественную очистку природных и техногенных экосистем. Образующие сероводород организмы могут быть использованы в биотехнологиях очистки от металлов сточных вод и отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей промышленности. Существует два основных пути образования H2S прокариотами – диссимиляционное и ассимиляционное восстановление сульфата. В процессе диссимиляционной сульфатредукции электроны от органических соединений/водорода переносятся на конечный акцептор – сульфат. Этот процесс приводит к запасанию энергии клетками сульфидогенных микроорганизмов, в том числе и сульфатредуцирующих прокариот (СРП), и образованию значительных количеств H2S. В процессе ассимиляционной сульфатредукции SO4 восстанавливается сульфидогенными бактериями в биосинтетических путях образования серосодержащих аминокислот. Впоследствии сбраживание органических соединений приводит к высвобождению восстановленной серы в форме сероводорода сульфидогенными бактериями (СГБ).

Несмотря на то, что процессы образования сульфидов металлов в природных и техногенных экосистемах вызывают пристальное внимание исследователей, их минералогический и химический состав химический состав остается малоисследованным. Основное внимание до сих пор было направлено на изучение образования диагенетического сульфида железа, пирита, в осадках Мирового океана. Образование сульфидов металлов отличных от железа остается малоизученным. Отчасти причиной этому является невозможность проведения экспериментов с чистыми культурами сульфидогенов из-за токсичности ионов тяжелых металлов (Ehrlich, 2003). Выделение чистых культур сульфидогенов устойчивых к ионам меди (Karnachuk et al., 2003; Карначук, 2006; Герасимчук и др., 2009) позволило провести в нашем исследовании изучение сульфидов Cu и Fe на новых модельных организмах.

Другой экосистемой, где образование сульфидов может иметь большое значение является кишечник человека и животных. Ранние исследования рассматривают образование H2S СРП с позиций цитотоксического действия на клетки организма человека (Macfarlane et al., 2007). До сих пор в научной литературе не обсуждалось возможное связывание металлов в сульфиды и переведение их в бионедоступную форму под действием биогенного сероводорода.

Таким образом, изучение образования сульфидов Cu и Fe сульфидогенными микроорганизмами имеет большое значение для понимания процессов самоочищения в природных экосистемах, важно для совершенствования биогеотехнологий и имеет приложение к пониманию функционирования микробиома человека.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении образования биогенных сульфидов меди и железа в природных экосистемах, а также в накопительных и чистых культурах устойчивых к металлам СРП и СГБ, выделенных из различных экосистем. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

Определить скорости образования восстановленных форм серы, включая кристаллические сульфиды Cu и Fe, в экспериментах по восстановлению 35SO2-4 в отходах добычи сульфидных руд.

Изучить биоразнообразие, определить распространение доминирующих филотипов Bacteria в отходах добычи сульфидных руд и исследовать влияние физико-химических факторов, связанных с добычей металлов, на распространение микроорганизмов.

Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов Cu и Fe, образующихся в накопительных культурах СГБ полученных из различных экосистем, в том числе из желудочно-кишечного тракта человека.

Изучить физико-химический и минералогический состав сульфидов меди и железа, образующихся в чистых культурах СГБ, принадлежащих к различным филогенетическим группам и осуществляющих диссимиляционную/ассимиляционную сульфатредукцию.

Оценить роль сульфидогенных бактерий в образовании сульфидов меди и железа.

Научная новизна работы. Впервые показано образование кристаллического сульфида меди, халькопирита (CuFeS2), чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий. Впервые детально изучено образование сульфидов меди представителями филума Firmicutes, включая диссимиляционных сульфатредукторов, Desulfosporosinus spp. и сульфидогенных бактерий, образующих H2S при разложении органических субстратов. Образование кристаллических фосфатов железа (вивианита) до настоящего времени не было известно для представителей из микробиома человека.

Впервые проведен подробный анализ элементного состава и минералогии осадков, образуемых чистыми культурами сульфидогенных бактерий, устойчивых к ионам меди и культивируемых в биопленках и биореакторе в условиях непрерывного культивирования. Исследование сопровождалось контролем образования частиц осадка с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Личный вклад соискателя. Автор осуществлял отбор проб хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области и определял скорости сульфатредукции. Выращивание чистых культур сульфидогенных бактерий в периодической и непрерывной культуре с ионами металлов автором проводилось самостоятельно. Изучение химического и минерального состава осадков хвостохранилищ и осадков, образованных СРП и СГП проводилось совместно с сотрудниками Центра коллективного пользования ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью ДГГЭ-анализа проводилось совместно со студентами учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось совместно с научным руководителем.

Практическая значимость работы. Показано, что процессы образования устойчивых к окислению кристаллических сульфидов Cu и Fe за счет активности СРП протекают в кислых и окисленных осадках хвостохранилищ добычи золота. Процессы микробной сульфатредукции могут представлять один из основных механизмов самоочистки этих экосистем. Данные по влиянию условий культивирования на соотношение химического и минералогического состава сульфидов Cu и Fe могут быть использованы при разработке биогеотехнологических процессов очистки стоков, загрязненных металлами. Запатентован процесс получения чистого ковеллита из стоков, содержащих ионы металлов с использованием устойчивого к Cu Desulfovibrio sp. А2.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на V молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 26-27 октября 2009); III Международной конференции по экологической, промышленной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld 2009» (Лиссабон, Португалия, 2-4 декабря 2009); 8 Международном конгрессе «Extermophiles» (Понта Дельгада, Азоры, Португалия, 12-16 сентября 2010); VI молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 25-27 октября 2010); 7 Международном совещании по меди «Copper in Biology» (Алгьеро, Сардиния, Италия, 16-20 октября 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улаанбаатар, 5-16 сентября 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, включая 4 публикаций в изданиях, рекомендованных ВАК, 18 других статей и материалов конференций и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей объекты исследования, материалы и методы и результаты исследования с обсуждением, заключением, выводом и списком литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 60 рисунков и 30 таблиц.

Место выполнения работы. Работа была выполнена в учебно-научной лаборатории биотехнологии и биоинженерии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета под руководством д.б.н., профессора О. В. Карначук. Определение скорости сульфатредукции в осадках хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области проведено во время стажировки в рамках гранта РФФИ по программе «Мобильность молодых ученых» в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва (ИНМИ РАН) под руководством к.б.н. И. И. Русанова и д.б.н. Н. В. Пименова.

Исследование образования сульфидов меди и железа СРП и СГП поддержано грантами Министерства образования и науки РФ по программе ФЦП №П336 от 07.05.2010, №11.519.11.2004 от 18.08.2011, №11.519.11.2011 от 30.08.2011.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. профессору О.В. Карначук, а также д.б.н. Н.В. Пименову, к.б.н. И.И. Русанову и к.б.н. А.Л. Герасимчук за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Искренне признательна Д. Бэнксу за определение концентрации металлов, катионов и анионов в пробах воды хвостохранилищ. Автор приносит благодарность всем соавторам, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. СУЛЬФИДОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ И ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ

В обзоре литературы приводится краткая характеристика физиологии, распространении и геохимической деятельности сульфидогенных бактерий, а также освещено образование сульфидов металлов в экосистемах и чистых культурах и использование СРП в технологических схемах.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика изученных экосистем, загрязненных тяжелыми металлами, и определение интенсивности сульфатредукции. Изучение образования сульфидов металлов СРП проводили в осадках хвостохранилищ добычи золота в Кемеровской области. Осадки хвостохранилищ на рудниках «Берикуль», «Комсомольское» и «Центральный» характеризовались низкими значениями рН, высокими значениями Еh и повышенным содержанием ионов металлов и сульфатов (таблица 1).

Определение интенсивности сульфатредукции и образования различных восстановленных форм серы в условиях максимально приближенных к in situ проводили в изолированных пробах осадков с применением радиоактивномеченного сульфата натрия (Карначук, 1990; Karnachuk et al., 2005). Определяли включение метки отдельно во фракции кислоторастворимых и кислотонерастворимых сульфидов.

Таблица 1 – Места отбора проб и некоторые физико-химические параметры воды ветландов

Место отбора проб

Обозначение пробы

Описание места отбора пробы

Т °С

рН воды

ОВП, мВ

Центральный

Том 13

Ветланд, получающий дренаж из отвалов породы

11.0

2.91

+392

Том 14

Ручей, вытекающий из штольни. На поверхности осадка биологические обрастания

16.2

2.72

+454

Комсомольское

Том 15

Естественный ветланд на территории хвостохранилища. Вода интенсивно красного цвета

18.2

1.96

+482

Том 16

Естественный ветланд на территории хвостохранилища

18.1

1.75

+370

Том 17

Ветланд, с водной растительностью

18.0

2.84

+431

Берикуль

Том 18

Высачивание из под отвала пустой породы на берегу реки Мокрый Берикуль

12.0

4.22

+413

Том 19

Естественный ветланд на территории бывшего хвостохранилища

24.1

2.43

+389

Том 20

Влажный осадок на территории бывшего хвостохранилища

24.0

2.76

+395

Том 21

Естественный ветланд с оранжевой водой невдалеке от отвала пустой породы.

22.7

2.06

+482

Новый Берикуль

Том 22

Естественный ветланд на территории бывшего хвостохранилища

20.5

2.99

*

* — Измерение не проводили

Молекулярные методы. ДНК выделяли набором «Power Soil DNA isolation kit» (MoBio, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Проводили «вложенную» (nested) амплификацию гена 16S рРНК с «внешними» праймерами 27F (DeLong, 1992) и 1492R (Weisburg et al., 1991), продукт который затем использовали в качестве матрицы для амплификации с «внутренними» праймерами BacV3f и 907R (Muyzer et al., 1996). Использовали амплификатор My Cycler (BioRad), температурный режим описанный ранее (Карначук и др., 2009). Доминирующие филотипы в осадках хвостохранилищ определяли методом амплификации фрагментов 16S рРНК с последующими разделением гель-электрофорезом в денатурирующих условиях (ПЦР-ДГГЭ). ДГГЭ проводили по описанной методике (Герасимчук и др., 2011). При ДГГЭ-анализе применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующими градиентами от 30 % до 70 % (100 % денатурирующий раствор содержит 7 М мочевину и 40 % формамид). Секвенирование проводили коммерчески (ЗАО «Синтол»). Анализ последовательностей ДНК проводили в соответствии с тем как это описано в публикации (2).

Эксперименты с чистыми и накопительными культурами. Накопительные и чистые культуры выращивали на пресноводной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992), Cu(II) и Fe(II) вносили в среду из стоковых растворов. Начальная концентрация металлов в среде составляла от 25 до 400 мг/л. рН среды составлял 2.5, 4 или 8, в зависимости от физиологии организмов. В качестве органического субстрата для роста использовали лактат или пептон. Также культивирование Desulfovibrio sp. A2 проводили в биореакторе BIOFLO110 Fermentor/Bioreactor NEW BRUNSWICK Scientific CO, INC, в непрерывном режиме. Культивирование проводили при 28 – 32 ºС, рН 7 – 8, скорость протока составляла 1-2 мл/мин.

Для исследования образования сульфидов меди и железа СРП использовали накопительные культуры, полученные из разных местообитаний (таблица 2).

Образование сульфидов Cu и Fe изучали в чистых культурах устойчивых к меди СРП, выделенных из различных экосистем (таблица 3). Важно отметить, что исследованные штаммы принадлежат к различным филогенетическим группа Bacteria – дельтапротеобактериальным родам Desulfovibrio и Desulfomicrobium, относящихся к Firmicutes Desulfosporosinus и Tissierella (рисунок 1).

Таблица 2 – Некоторые характеристики накопительных культур сульфидогенов, использованных в экспериментах по изучению образования сульфидов металлов

Культуры

Источник выделения

Субстрат

для роста

Концентрация Сu2+, мг/л

Том 17

Осадки хвостохранилища сульфидных руд, проба Том 17

Лактат

25

Том 19

Осадки хвостохранилища сульфидных руд, проба Том 19

Лактат

25

LC_3

Гидротермальное поле Лост Сити, Постройка с водой, проба М2 4800№2

Лактат

0.002

LC_4

Гидротермальное поле Лост Сити, проба М2 ТБС 4403

Лактат

0.002

5_С

Фекалии человека

Пептон

100

6_С

Фекалии человека

Пептон

100

Таблица 3 – Чистые культуры СРП и СГБ использованные в исследованиях и максимальная концентрация ионов Cu в среде, позволяющая их рост

Штаммы СГБ

Источник выделения

Концентрация Сu2+, мг/л

Dеsulfomicrobium sp. KN

Осадки, загрязненные отходами предприятия ОАО “Норильский никель”

400

Desulfovibrio sp. R2

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

800

Desulfovibrio sp. А2

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

450

Desulfovibrio sp. А4

Сточные воды предприятия по производству шариков подшипников

325

Desulfosporosinus sp. DB

Загрязненные металлами осадки хвостохранилищ добычи золота, Кузбасс

5000

Desulfosporosinus sp. ОТ

Cтоки предприятия по обогащению и извлечению цветных металлов из руд, ОАО «Норильский никель»

15000

Tissierela sp. P1

Поверхность медных монет

150

Tissierela sp. F6



Страницы: 1 | 2 | Весь текст