Цитоскелетные компоненты мышечных волокон и коллаген в условиях

На правах рукописи

ЧИСТЯКОВ ИЛЬЯ НИКОЛАЕВИЧ

ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН И КОЛЛАГЕН В УСЛОВИЯХ РЕАЛЬНОЙ И МОДЕЛИРУЕМОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКИ

03.03.01 – физиология

03.03.04 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович

доктор медицинских наук, заместитель директора, профессор Маевский Евгений Ильич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится « » ______ 2010 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 при Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ — ИМБП РАН.

Автореферат разослан «___» ___________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наукЛевинских М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Увеличение длительности космических экспедиций и расширение круга решаемых в полете двигательных задач повышает значение бортовой профилактики, прогнозирования эффектов гравитационной разгрузки и борьбы с двигательными нарушениями. Необходимость контроля и сохранения нормальной функции скелетных мышц требует комплексного исследования физиологических механизмов и закономерностей адаптационных процессов, обеспечивающую функциональные изменения, адекватные изменению биомеханической среды. Согласно этическим нормам [Генин А.М. соавт. 2001], человека нельзя подвергать неблагоприятным воздействиям, что затрудняет корректный анализ феноменологии процессов и физиологических механизмов атрофии мышечной ткани человека. Экспериментальные исследования на животных позволяют провести более детальный анализ исследуемых процессов и изучить механизмы структурно-функциональных перестроек, с применением более жестких, чем это возможно для человека, методов воздействия и методик исследования [Booth F.W. 1982; Fitts R.H. 1986; Belozerova I.N. 2002; Adams G.R. et al. 2003].

Известно, что у человека после космического полета наблюдается снижение функциональной активности скелетных мышц [Oganov V.S. et al. 1976; Козловская И.Б. соавт. 1984; Martin T. 1988; Leach C.S. 1992; Shenkman B.S. et. al. 1994, 1996; Edgerton V.R. et al 1998; Adams G.R. et al. 2003]. В литературе описаны такие изменения скелетных мышц, вызванные гравитационной разгрузкой, как снижение объема мышцы [Dapp K. et al., 1989; Kozlovskaya I. B. et al. 1996; Desplanсhes D. et al. 1997], избирательное уменьшение площади поперечного сечения (ППС) мышечного волокна [Оганов В.С. соавт. 1982; Riley D.A. et al. 2002], изменения спектра изоформ тяжелых цепей миозина в пользу миозина быстрого типа [Takacs et al. 1980; Caiozzo V.J. et al. 1994], разнонаправленные изменения в сети десминовых филаментов [Nara K. et al. 2002], нарушения целостности дистрофинового слоя сарколеммальной мембраны [Гасникова Н.М. соавт. 2006; Chopard A. et al. 1998, 2005], увеличение объёма экстрацеллюлярного матрикса [Karpakka J. et al. 1991; Miller T.D. et al. 2001; Kjaer M. 2004]. Данные современных исследований качественных и количественных изменений белков внутриклеточного цитоскелета и экстрацеллюлярного матрикса постуральных мышц в условиях микрогравитации по-прежнему остаются единичными.

Архитектура скелетно-мышечной клетки определяется балансом сил напряжения внутреннего актинового цитоскелета, костамеров и внеклеточного цитоскелета, формирующих систему самоорганизующихся напряженных модулей и обладающих координированной активностью. Действие микрогравитации на мышечную клетку реализуется через ряд механизмов, которые можно условно разделить на внешние системные, (изменение биомеханики движений, отсутствие опоры и снижение сопротивления среды, нейрорегуляторные и гормональные воздействия) и внутренние местные, (накопление ионов Са2+ в мышечном волокне, нарушение процессов белкового синтеза, усиление протеолиза и др.). Гравитационно-зависимые изменения мышечных белков носят комплексный характер, затрагивающий все структурные уровни, и приводят к компенсаторной адаптации мышцы [Oganov V.S. et al. 1980, 1981, 1982, 1990; Edgerton V.R. et. al. 1998; Fitts R.H. et. al. 2000]. Состояние постуральных скелетных мышц во многом зависит от изменений компонентов саркомера (актин, миозин, титин, небулин, белки М-линии), внесаркомерного цитоскелета (десмин), сарколеммальных белков, формирующих костамеры (дистрофин) и экстрацеллюлярного матрикса (интегрин, коллаген).

На сегодняшний день нет ясного понимания физиологической роли промежуточных филаментов (ПФ) десмина в работе скелетных мышц в нормальных условиях. Известно, что экстрамиофибриллярный цитоскелет десмина, опосредованно через синкоилин и десмуслин/сименин, крепится к мембранным адгезивным комплексам, показана прямая связь между десмином и спектрином и анкерином, непосредственное взаимодействие десмина с белком интрафибриллярного цитоскелета небулином [Capetanaki Y. et al. 2002]. В исследованиях на десмин-/- мышах показано, что нарушение синтеза десмина приводит к разуплотнению саркомеров, нарушению латерального выравнивания миофибрилл и их связи с сарколеммой, потере формы и позиционирования ядра, дегенерации, нарушению локализации и изменению формы митохондрий, нарушению клеточной адгезии и расширению межклеточного пространства. Интересно, что в медленных мышцах концентрация десмина вдвое больше, чем в быстрых мышцах, что может определять физиологические особенности постуральных скелетных мышц. Однако, литературные данные, посвященные влиянию гравитационной разгрузки на свойства ПФ десмина в медленной (камбаловидной) мышце в настоящий момент остаются единичными и часто недостоверными [Chopard A. et al. 2005, Capetanaki Y. et al. 2007; Dapp et al. 2004, Nara K. 2002; Enns et al. 2007].

Сложность механизма регуляции коллагеногенеза, включающего перекрёстное влияние различных сигнальных путей (↑)TGF-β и (↓)TNF-α, факторов роста (IGF-1, b-FGF, VEGF, PDFG), простагландинов, цитокинов (Ил-1, Ил-6, Ил-8), NO, активации/подавления ММР-2/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 [Sakuma K. et. al., 2000; Kjaer M., 2004], не позволяет сформировать чёткой гипотезы гравитационно-зависимых изменений.

Целью настоящего исследования являлся экспериментальный гистоморфологический анализ изменений цитоскелетных и экстрацеллюлярных белковых структур мышц человека и животных при различной длительности гравитационной разгрузки, а также в условиях дополнительного механического и фармакологического воздействия.

Задачи исследования:

Изучить динамику объёма десминовых и дистрофиновых структур мышечного волокна и объема коллагеновых структур I и III типа в скелетных мышцах животных на разных сроках моделируемой гравитационной разгрузки.

Проверить гипотезу о роли накопления ионов кальция в изменении характеристик цитоплазматических и экстрацеллюлярных белковых структур в постуральных мышцах животных в условиях гравитационной разгрузки и возможность использования блокаторов кальция для предотвращения этих изменений.

Проверить гипотезу об эффектах пассивного растяжения на коллагеновые и десминовые структуры в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.

Научная новизна:

Определена динамика изменений компонентов внутриклеточного цитоскелета (десмина, дистрофина) и экстрацеллюлярного матрикса (изоформ коллагена I и III типа) МВ камбаловидной мышцы животных при разных сроках гравитационной разгрузки.

Выявлены качественные и количественные изменения в структуре изоформ коллагена экстрацеллюлярного матрикса МВ, увеличение доли изоформы коллагена Ш типа к поздним срокам гравитационной разгрузки.

Показана возможность частичного предотвращения увеличения общего объёма, изменения изоформного состава коллагена и сохранения дистрофинового слоя мышечного волокна камбаловидной мышцы крысы при 14-суточном антиортостатическом вывешивании, сочетанном с хроническим введением блокатора кальциевых каналов L-типа, нифедипина.

Показано, что пассивное растяжение на фоне антиортостатического вывешивания камбаловидной мышцы крысы позволяет частично предотвратить увеличение общего объёма и состава изоформ коллагена I и III типа.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Настоящее исследование расширяет понимание физиологических и биохимических структурных изменений, происходящих в скелетной мускулатуре животных и человека при гравитационной разгрузке. Полученные результаты могут использоваться при разработке методов профилактики негативного воздействия невесомости. Разработанные иммуногистохимические (ИГХ) и топогистохимические (ТГХ) методы морфологического исследования цитоскелетных и экстрацеллюлярных белков скелетных мышц успешно используются клинической практике, в том числе в гинекологии и неврологии.

Положения, выносимые на защиту:

Нарастание общего объёма коллагена в камбаловидной мышце при моделируемой гравитационной разгрузке прямо пропорционально её продолжительности и сопровождается увеличением доли изоформы коллагена III типа и уменьшением доли изоформы коллагена I типа.

Адаптация системы промежуточных филаментов десмина к условиям гипогравитации происходит на ранних сроках гравитационной разгрузки, к 7-м суткам активность процесса адаптации существенно снижается.

Пассивное растяжение мышцы и введение блокатора кальциевых каналов L-типа позволяет частично предотвратить деструкцию цитоскелетных сократительных и несократительных белковых структур в условиях гравитационной разгрузки.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на IV, V, VI «Конференциях Молодых Учёных» (Москва ГНЦ РФ ИМБП РАН, 2004, 2005, 2007). На XXXIV European Muscle Conference, Hortobari, Hungary, 2005, P.17. На «XIII международном совещании» и «VI школе по эволюционной физиологии», Санкт-Петербург, 23-28.01.2006. На 27th Annual International «Gravitational Physiology Meeting», Osaka, Japan, 2006. На 16th IAA «Human in Space» Symposium, 21-24.05.2007. На VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», 2007, Москва.

Диссертация апробирована на секции Учёного совета 10.11.2009 г. ГНЦ РФ — ИМБП РАН.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 136 страницах, иллюстрирован 15 рисунками. Полученные данные представлены в 14 таблицах и 34 графиках. Список литературы включает 317 источника, из них 20 – работ отечественных и 297 — иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили биоптаты мышечной ткани человека (4 участника экспедиции на МКС) и животных. В работе были использованы 194 половозрелых самца крыс линии Wistar, 24 самцов монгольской песчанки, 19 самцов мышей линии MDX и 19 самцов мышей линии C57black. Протоколы исследований с участием человека и эксперименты на животных были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН.

Методы исследования

Исследование экспериментального материала производилось с использованием микроскопа Leica. Анализ микропрепаратов проводился не менее чем на 100 волокнах каждого среза с помощью системы анализа изображений QUANTIMET-500 (Leica, Германия) с цветной цифровой видеокамерой Leica DC-300. Оценка анализируемых параметров проводилась на снимках высокого разрешения (Tiff) с использованием программного обеспечения Leica QWin.

Топогистохимическое выявление коллагена

Для выявления изоформ коллагена I и III типа использовалась гистохимическая реакция Picrosirius Red (Direct Red) с выявлением окраски фосфомолибденовой кислотой [Miller et al., 2001]. Объем общего коллагена на поперечном срезе определяется следующим образом: Доля площади коллагена I типа + доля площади коллагена III типа / ППС среза (рамка измерений). Процентное соотношение изоформ коллагена определяется по следующему уравнению: I (III) тип коллагена % = [ППС I (III) типа / (ППС I типа + ППС Ш типа)] x100.

Иммуногистохимическое выявление десмина

Окраска проводилась с использованием стандартного протокола двойного иммуномечения. При оценке количества десмин-негативных волокон производился прямой подсчёт всех волокон видимого среза. Рассматриваемые волокна считались десмин-негативными, если при окрашенном контуре волокно не имеет чёткого внутреннего окрашивания. Иммуногистохимическое выявление дистрофина

Окраска проводилась с использованием стандартного протокола двойного иммуномечения. Состояние дистрофинового слоя анализировали с использованием стандартизованного метода подсчёта процентного соотношения мышечных волокон с разрывами субсарколеммальной мембраны. В норме дистрофиновый слой выглядит как непрерывная линия, расположенная на внутренней границе волокна. В некоторых волокнах имеются участки, на которых целостность дистрофинового слоя нарушена.

Статистическая обработка

Оценку значимости различия средних значений показателя в независимых выборках проводили по t-критерию Стьюдента, который вычисляли по формуле t = M1 – M2 / √(m12 – m22), где М1 и М2 – средние арифметические значения показателя в сравниваемых группах, m1 и m2 – средние квадратичные ошибки среднего арифметического значения показателя. В связанных выборках расчет t-критерия проводили по формуле t = ∆М / m∆М, где ∆М – средняя разность показателя в сравниваемых группах, m∆М – средняя квадратичная ошибка средней разности показателя. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали значимым при уровне значимости p≤0,05. Результаты представлены в виде М±m [Ю.В.Прохоров, 2003].

Организация экспериментов

Структура исследований, вошедших в диссертацию представлена в табл. 1

Таблица 1. Структура проведенных исследований

Цели исследования

Условия

Объект

Объём исследований

1

Исследование влияния реальной гравитационной разгрузки* на изоформный состав и объём белков цитоплазматического цитоскелета и экстрацеллюлярного матрикса скелетных мышц человека и животных.

*-условий космического полёта

1.Бортовой эксперимент «МИОН» в рамках экспедиций МКС № 6,7,8 (2002-2005 гг.) Продолжительность полёта составила 185, 193 и 188 суток. Биоптаты m.soleus человека.

4 человека

ИГХ выявление МВ с разрывами дистрофинового слоя m.soleus человека.

ТГХ общего объёма и состава изоформ коллагена m.soleus человека.

ТГХ общего объёма и состава изоформ коллагена m.soleus и m.tibialis ant. монгольских песчанок.

2.Бортовой эксперимент «ФОТОН — М3» в рамках программы ФКА и РОСКОСМОС. Продолжительность полёта составила 12 суток. Биоптаты m.soleus и m. tibialis ant. монгольских песчанок.

24 монгольских песчанки

2

Определение динамики изменений изоформного состава и объёма белков цитоплазматического цитоскелета и внеклеточного матрикса скелетных мышц крысы на разных сроках гравитационной разгрузки.

Антиортостатическое вывешивание крыс 3-, 7-, 14-, 30- суток. 10 групп:

«Контр» (х5) (n=35, m=242±15 г)

«Выв. — HS3d» (n=7, m=237±15г)

«Выв. — HS7d» (n=7, m=218±15г)

«Выв. — HS14d» (n=7, m=205±15г)

«Выв. — HS30d» (n=7, m=175±15г)

Забой — нембутал (200мг/кг).

72 крысы Wistar

ИГХ выявление десмин-негативных МВ

ИГХ выявление МВ с разрывами дистрофинового слоя.

ТГХ выявление общего объёма коллагена

ТГХ выявление состава изоформ коллагена.

3

Проверка гипотезы о роли накопления Са2+ в развитии изменений цитоплазматических и экстрацеллюлярных белков в постуральных мышцах животных в условиях гравитационной разгрузки и возможность использования хелаторов кальция для предотвращения этих изменений.

1. Антиортостатическое вывешивание крыс (14 суток) с внутрибрюшинным введением ЭГТА 30 мг/48ч. 3 группы:

«Контр+физ. р-р» (n=7, m=256±15г)

«Выв.+физ. р-р» (n=7, m=237±15 г)

«Выв.+ЭГТА» (n=7, m=212±15)

Забой — нембутал (200мг/кг).

21крыса Wistar

ИГХ выявление десмин десмин-негативных МВ

ИГХ выявление МВ с разрывами дистрофинового слоя

ТГХ выявление общего объёма коллагена

ТГХ выявление состава изоформ коллагена.

2. Антиортостатическое вывешивание крыс (14 суток) с энтеральным введением Нифедипина 7 мг/кг /24ч.

«Контроль» (n=12, 238±15)

«Вывешивание» (n=12, 195+15г)

«Выв+Нифедипин» (n=12, 190+15г)

Забой — нембутал (200мг/кг).

36 крыс Wistar

4

Проверка гипотезы об эффектах пассивного растяжения, участии дистрофина и механизмах рекрутизации компонентов внутриклеточного цитоскелета и ЭЦМ постуральных мышц животных в условиях моделированной гравитационной разгрузки

1. Антиортостатическое вывешивание (14 суток) на фоне пассивного растяжения мышц голени крыс

«Контроль» (n=8, 240±15)

«Вывешивание» (n=7, 200+15г)

«Выв+Раст» (n=7, 195+15г)

Забой — нембутал (200мг/кг).

22 крысы Wistar

ИГХ выявление десмин десмин-негативных МВ

ИГХ определение относительной оптической плотности десмина в МВ

ИГХ выявление МВ с разрывами дистрофинового слоя

ТГХ выявление общего объёма коллагена

ТГХ выявление состава изоформ коллагена.

2. Локальное облучение мышц вывешенных крыс (14 суток) на фоне пассивного растяжения голени

γ — облучение 2500 рад /15 мин, кобальт-60

«Контроль» (n=7, m=230±15г)

«Облучение» (n=8, m=200±15г)

«Вывешивание» (n=7, m=190±15г)

«Вывешивание + облучение» (n=7, m=185±15г)

«Растяжение» (n=7, m=225±15г)

«Растяжение + облучение» (n=7, m=225±15г)

Забой — нембутал (200мг/кг).

43 крысы Wistar

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Эффекты реальной невесомости (условий космического полёта)

1.1 Исследование влияния реальной гравитационной разгрузки на изоформный состав и объём белков цитоплазматического цитоскелета и экстрацеллюлярного матрикса скелетных мышц человека

В ходе изучения биоптатов m. soleus четырёх членов экипажей МКС во всех исследованных случаях было обнаружено, что количество мышечных волокон с нарушениями дистрофинового слоя после космического полёта (~180 суток) было достоверно выше предполётных показателей. При этом было обнаружено высокое содержание таких волокон в предполетном периоде (21,7; 14,1; 22,7%). У космонавтов A и D количество волокон с разрывами дистрофинового слоя увеличилось в 3 раза, у космонавта B в 1,9 раза, у космонавта C в 2,1 раза. Однако, адекватный анализ данных изменений затруднён с одной стороны воздействием усиленных физических тренировок в предполётном периоде, и воздействием реадаптационной нагрузки при отложенном взятии биоптатов после завершения космического полёта.

Доля общего объёма коллагена достоверно увеличилась у всех членов экспедиции. При этом у космонавта А общий объем соединительной ткани увеличился на 112 %, у космонавта В на 69,8 %, у С космонавта до 106%. При этом достоверных изменений соотношения долей изоформ коллагена I и III типа у космонавтов А и В обнаружено не было. Интересно, что у космонавта С наблюдалось примерно равное распределение I и III изоформ коллагена до и после полёта. Таким образом, у всех испытателей наблюдалось достоверное увеличение общего объёма коллагена, без достоверных изменений изоформного состава.

1.2 Влияние реальной гравитационной разгрузки на объём и состав изоформ коллагена мышечных волокон m. soleus и m. tibialis anterior монгольской песчанки

При анализе мышечных волокон животных в течение 12 суток находящихся на борту биоспутника ФОТОН М3 было обнаружено достоверное увеличение доли общего коллагена в m. soleus на 21,4%, в m. tibialis anterior на 23,5%.

Изменения процентного соотношение изоформ коллагена I и III типа после 12 суточного полёта в m. soleus не обнаружено, прирост изоформы коллагена I типа составил 12%, изоформы коллагена III типа – 11%.

В m. tibialis anterior прирост изоформы коллагена I типа составил 8%, изоформы коллагена III типа – 12%.

Известно, что m. tibialis anterior, антагонист m. soleus, активируется в условиях невесомости [Alford E.K. et al., 1987], поэтому можно было ожидать, что атрофические изменения в нем будут слабее выражены. Однако, после 12 суточного космического полёта, увеличение общего объёма коллагена m. tibialis anterior монгольской песчанки и изменение состава изоформ коллагена I и III типа оказалось более выраженным. Известно, что экстрацеллюлярное окружение медленных волокон крыс плотнее быстрых, соответственно адаптивный ответ медленных и быстрых мышц может быть различным. Вероятно, более слабая реакция m. soleus песчанок на действие невесомости может быть связана с физиологическими особенностями (паракринной регуляцией) этого животного, которые до настоящего времени не достаточно изучены.

2. Динамика изменений компонентов внутриклеточного цитоскелета и экстрацеллюлярного матрикса камбаловидной мышцы крысы при моделируемой гравитационной разгрузке

В настоящем исследовании было проведено исследование динамики морфологических изменений различных компонентов внутриклеточного цитоскелета и внеклеточного матрикса в m. soleus крысы на разных отрезках времени в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.



Страницы: 1 | 2 | Весь текст