Циклоспорин а-чувствительное, кальций-независимое разобщающее де

На правах рукописи

РЫБАКОВА СНЕЖАНА РАФАИЛОВНА

Циклоспорин А-чувствительное, кальций-независимое разобщающее действие

жирных кислот в митохондриях печени крыс

03.01.04 ─ биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань 2013

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии и в лаборатории молекулярной биоэнергетики ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет» (г. Йошкар-Ола)

Научный руководитель: Самарцев Виктор Николаевич,

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Минибаева Фарида Вильевна, доктор

биологических наук, заведующая лабораторией окислительно-восстановительного метаболизма Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Казанский институт биохимии

и биофизики» Казанского научного центра РАН

Амерханов Зариф Гариевич, кандидат

биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний Института биофизики клетки РАН (г. Пущино) учреждения РАН

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Защита диссертации состоится «14» ноября 2013 г. в 13.00 часовна заседании диссертационного совета Д 212.081.08 ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Автореферат разослан «___» ___________2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор

биологических наук, профессор Абрамова Зинаида Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В клетках печени от 20 до 30% потребления кислорода митохондриями не связано с синтезом АТР (Rolfe and Brand, 1997). Такое, так называемое, свободное окисление имеет важное физиологическое значение (Skulachev, 1998; Echtay, 2007). Одним из основных механизмов свободного окисления в митохондриях является пассивная утечка протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, которая может быть усилена с помощью природных протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования свободных монокарбоновых жирных кислот (Skulachev, 1998). В митохондриях печени протонофорное разобщающее действие жирных кислот почти на 80% осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров (Skulachev, 1998; Самарцев и др., 2011). Все еще не ясно, чем обусловлена оставшаяся часть разобщающей активности жирных кислот.

Естественными метаболитами монокарбоновых жирных кислот являются α,ω-диоловые (α,ω-дикарбоновые) кислоты, образующиеся в клетках печени путем ω-окисления их монокарбоновых аналогов (Ferdinandusse et al., 2004; Wanders et al., 2011). Показано, что одна из таких кислот – α,ω-тетрадекандиоловая, стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала (Маркова и др., 1999). Необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на выяснение механизма разобщающего действия как монокарбоновых жирных кислот, так и α,ω-диоловых кислот.

В качестве возможного инструмента для исследования действия жирных кислот наше внимание привлек циклоспорин А, нейтральный липофильный циклический ундеканпептид, хорошо известный как эффективный иммуносупрессор (Schreiber and Crabtree G.R., 1992; Mathieson, 2000). В митохондриях печени циклоспорин А связывается с высоким сродством с пептидил-пролил цис-транс изомеразой (циклофилин D) и препятствует индукции кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры) уже при его концентрации 150 – 300 нМ (Halestrap and Davidson, 1990; Andreeva and Crompton, 1994). Вместе с тем остается не известным, как влияет циклоспорин А в более высокой концентрации (5 – 10 мкМ) на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени. Можно предположить, что циклоспорин А, будучи нейтральным липофильным соединением, но в то же время имея способные формировать водородные связи полярные группы, в высокой концентрации мог бы оказывать влияние на разобщающее действие свободных моно- и дикарбоновых жирных кислот.

Митохондрии печени месячных крысят массой 50 г. по сравнению с митохондриями печени взрослых крыс массой 250 г. имеют более высокую скорость дыхания как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты (Самарцев и др., 2004). Представляет интерес выяснить как влияет циклоспорин А на разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени крыс различного возраста.

Цель работы: выяснение механизма циклоспорин А-чувствительного, кальций-независимого разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

1.Выявить влияние циклоспорина А в концентрации 5-10 мкМ на показатели дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс.

2.Исследовать действие циклоспорина А (5-10 мкМ) на стимулированное пальмитиновой и лауриновой кислотами дыхание митохондрий печени крыс.

3.Определить влияние циклоспорина А в концентрации 5-10 мкМ на сниженный жирными кислотами мембранный потенциал митохондрий печени крыс.

4.Исследовать влияние α,ω-тетрадекандиоловой кислоты на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени крыс в отсутствии и присутствии циклоспорина А.

5.Сравнить влияние циклоспорина А в эффективной концентрации на стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий печени крыс разного возраста.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния циклоспорина А в различных и в особенности в высоких для его применения концентрациях на показатели дыхания и окислительного синтеза АТР митохондрий печени крыс как в отсутствии, так и в присутствии природных разобщителей окислительного фосфорилирования свободных моно- и дикарбоновых жирных кислот. Показано, что в концентрации вплоть до 10 мкМ циклоспорин А не оказывает влияния на дыхание митохондрий печени в состояниях 2 и 4, а также при условии максимальной стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом. В этой же концентрации циклоспорин А вызывает небольшое снижение скорости дыхания в состоянии 3 и скорости фосфорилирования ADP (окислительного синтеза АТР). Впервые установлено, что в концентрации 5 – 10 мкМ циклоспорин А в митохондриях печени способен ингибировать разобщающее действие пальмитиновой и лауриновой кислот как в отсутствие, так и в присутствии карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата) и такое его действие не сопровождается повышением мембранного потенциала. В такой же высокой концентрации циклоспорин А полностью устраняет способность α,ω-тетрадекандиоловой кислоты обратимо стимулировать дыхание митохондрий печени в отсутствие синтеза АТР. На основании полученных результатов сформулирована оригинальная гипотеза о том, что в митохондриях печени крыс составляющая разобщающего действия монокарбоновых жирных кислот, чувствительная к циклоспорину А, и разобщающее действие α,ω-диоловых кислот осуществляется по одному и тому же механизму внутреннего разобщения. Впервые показано, что способность пальмитиновой кислоты стимулировать дыхание митохондрий печени крыс по механизму внутреннего разобщения зависит от возраста этих животных – больше в митохондриях крысят, чем взрослых крыс.

Научно-практическое значение работы. Полученные при выполнении диссертационной работы научные результаты имеют, прежде всего, фундаментальное биологическое значение. Они расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции свободного окисления в митохондриях животных. Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биохимии, биофизики, биоэнергетики, а также в области экспериментальной медицины. Новые знания, полученные при выполнении диссертации, в перспективе могут быть использованы для разработки методов и средств управления термогенезом у млекопитающих путем изменения активности свободного окисления в митохондриях.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1.В митохондриях печени животных составляющая часть разобщающей активности монокарбоновых жирных кислот, не связанная с функционированием ADP/ATP- аспартат/глутаматного антипортеров, и разобщающая активность α,ω-дикарбоновых кислот осуществляется по одному и тому же механизму внутреннего разобщения.

2.Циклоспорин А в концентрации 10 мкМ может быть использован как инструмент для оценки степени индукции моно- и α,ω-дикарбоновыми жирными кислотами внутреннего разобщения в митохондриях печени животных.

3.Активность пальмитиновой кислоты как индуктора свободного окисления в митохондриях печени крыс по механизму внутреннего разобщения зависит от возраста этих животных.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009 г); на первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010 г.); на 15-ой и 16-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2011 и 2012 г.); на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011 г.); на Международной конференции молодых ученых 22-24 октября 2012 г. «Экспериментальная и теоретическая биофизика `12» (Пущино, 2012 г.); на I Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010 г.); на тринадцатой постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием «Глобализация. Глобалистика. Потенциалы и перспективы России в глобальном мире» (Йошкар-Ола 2010 г.); на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы экологии, биологии и химии» (Йошкар-Ола 2010 г.); на IV съезде биофизиков России 20-26 августа 2012 г. (Нижний Новгород, 2012 г.).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009 – 2011 годы)» (№ 2.1.1/13090) и Федеральной целевой программы Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение 14.В37.21.0191).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 11 статей, тезисов докладов региональных, всероссийских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах, включая список литературы, иллюстрационный материал включает 33 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. В работе были использованы белые беспородные крысы-самцы в возрасте 9 – 12 месяцев с массой тела 220 – 260 г и месячные крысята массой 50 г. Содержание, кормление и забой животных соответствовали необходимым требованиям, изложенном в соответствующем руководстве (Западнюк и др., 1983), а также международным правилам «Guide for the Care and Use of Animals» и правилам, утвержденным в системе Министерства высшего и среднего образования СССР (Приказ № 742 от 13 ноября 1984 г.).

Выделение митохондрий. Митохондрии из печени крыс выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим удалением эндогенных жирных кислот с помощью БСА (Samartsev et al., 1997a). Среда выделения содержала 250 мМ сахарозу, 1 мМ EGTA и 5 мМ HEPES- трис (рН 7,4). Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали БСА.

Регистрация дыхания митохондрий. Дыхание митохондрий регистрировали при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа LP-9 и открытого кислородного электрода (Кондрашова и др., 1973). Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке ~1,1 – 1,2 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарную кислоту, 0,5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES-трис (рН 7,4).

Оценка параметров окислительного фосфорилирования митохондрий. При исследовании окислительного фосфорилирования среда инкубации без олигомицина дополнительно содержала 5 мМ КН2РО4 (Pi) и БСА (0,2 мг/мл). Применяли следующие показатели дыхания и окислительного фосфорилирования: J2 – скорость дыхания митохондрий в присутствии Pi до добавления ADP (состояние 2 по Чансу); J3 – скорость дыхания митохондрий в присутствии Pi и ADP (состояние 3 по Чансу); J4 – скорость дыхания митохондрий в присутствии Pi после того, как весь добавленный ADP был израсходован в процессе синтеза АТР (состояние 4 по Чансу); RC – отношение величин J3 и J4 (дыхательный контроль по Чансу); Ju – скорость дыхания митохондрий в присутствии протонофорного разобщителя 2,4-динитрофенола в концентрации, вызывающей максимальную стимуляцию дыхания; ADP/O – стехиометрический коэффициент, показывающий эффективность окислительного фосфорилирования; Jр – скорость синтеза АТР. Размерность величин J2 , J3 , J4 и Ju – нмоль О2/ мин на 1 мг белка; размерность величины Jр – нмоль ADP / мин на 1 мг белка; размерность величин RC и ADP/O – относительные единицы. Значение коэффициента ADP/O определяли пульсовым методом (Hinkle and Yu, 1979). Значение величины Jр определяли как удвоенное произведение величин J3 и ADP/O.

Оценка разобщающей активности жирных кислот. Для количественной оценки разобщающей активности жирных кислот в соответствии с известной методикой (Самарцев и др., 2004), использовали величину стимуляции дыхания этой жирной кислотой (JU), определяемую как разность между скоростью дыхания митохондрий (нмоль О2/ мин на 1 мг белка) после и до добавления жирной кислоты. Величина JU рассматривается как состоящая из трех частей – чувствительная к карбоксиатрактилату (JC), чувствительная к глутамату (JG) или к аспартату (JA) и чувствительная к циклоспорину А (JCsA). Величину JC определяли как разность между скоростью дыхания митохондрий в присутствии жирной кислоты до и после добавления карбоксиатрактилата, а величину JG – как разность между скоростью дыхания митохондрий в присутствии жирной кислоты и карбоксиатрактилата до и после добавления глутамата. Использовали также величину удельной разобщающей активности (VU) и ее составляющие: чувствительную к карбоксиатрактилату (VC), чувствительную к глутамату (VG) и чувствительную к циклоспорину А (VCsA). Величины VU, VC и VG определяли как частное от деления величин JU, JC и JG соответственно на концентрацию жирной кислоты. Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата, глутамата или аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии жирной кислоты одним из этих ресопрягающих агентов к величине стимуляции дыхания этой жирной кислотой по формуле 100·ΔJu/(JuJo), где Ju и Jo – скорости дыхания соответственно в присутствии и в отсутствии жирной кислоты, ΔJu – снижения скорости дыхания ресопрягающим агентом (Самарцев и Кожина, 2008).

Регистрация изменения разности электрических потенциалов (ΔΨ) на внутренней мембране митохондрий. Изменение ΔΨ на внутренней мембране митохондрий оценивали по изменению концентрации ТФФ+ в среде инкубации с помощью ТФФ+-чувствительного электрода (Kamo et al., 1979) при 25°С при постоянном перемешивании в открытой ячейке объемом 2 мл. В этих экспериментах в среду инкубации дополнительно добавляли 1,6 мкМ ТФФ+.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные были обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента с использованием пакета прикладных компьютерных программ «Statistica». Для оценки значимости различий использовали уровень вероятности Р < 0,05.

Химические реактивы. В работе использовали HEPES, α,ω-тетрадекандиоловую кислоту (ТДК), олигомицин, янтарную кислоту, пальмитиновую и лауриновую кислоты, циклоспорин А, очищенный от жирных кислот БСА, карбоксиатрактилат, аспартат калия, глутамат калия, трис(оксиметил)аминометан, хлорид тетрафенилфосфония («Sigma», США), ротенон, EGTA («Serva», Германия), ADP, 2,4- динитрофенол, KCl (“Fluka” Швейцария), KH2PO4, MgCl2 («Merck», Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние циклоспорина А на показатели дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени

В состоянии 2, т.е. при условии отсутствия синтеза АТР и без разобщителей, митохондрии потребляют кислород с небольшой скоростью, а циклоспорин А даже в концентрации 10 мкМ не оказывает какого-либо существенного влияния на скорость дыхания (рис. 1, кривая а). Классический протонофорный разобщитель ФКФ, будучи добавленный к митохондриям печени в концентрации 60 нМ, стимулирует дыхание в 2 раза, и при этих условиях циклоспорин А также не эффективен (рис. 1, кривая б).

Как показано в таблице 1, циклоспорин А в концентрации 10 мкМ не оказывает влияния на скорости дыхания в состоянии 2 (J2), в состоянии 4 (J4), а также на скорость дыхания при максимальном разобщающем действии 50 мкМ 2,4-динитрофенола (Ju), но снижает как скорость дыхания в состоянии 3 (J2), так и скорость фосфорилирования ADP (JР) на 18% (таблица 1). Вместе с тем при этих условиях циклоспорин А не оказывает влияния на характеризующие эффективность окислительного фосфорилирования коэффициенты RC и ADP/O (таблица 1).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что циклоспорин А в концентрации 10 мкМ, т.е. в значительно большей, чем та в которых он обычно применяется для подавления индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (Halestrap and Davidson, 1990; McGuinness et al., 1990; Andreeva and Crompton, 1994), не оказывает влияния на дыхание митохондрий печени в состояниях 2 и 4, а также при условии максимальной стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом. В этой же концентрации циклоспорин А вызывает небольшое снижение скорости дыхания в состоянии 3 (J3), и скорости фосфорилирования ADP, что, по-видимому, связано с влиянием этого пептида непосредственно на систему синтеза АТР (F0F1-АТР-синтаза) и (или) на обменный транспорт ADP на АТР через внутреннюю мембрану митохондрий.

Рис. 1. Отсутствие влияния циклоспорина А на дыхание митохондрий печени в состоянии 2 (а) и при условии стимуляции дыхания ФКФ в 2 раза (б). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, среда инкубации дополнительно содержала БСА (0,2 мг/мл). Мит – митохондрии печени (1 мг/мл), ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ФКФ – 60 нМ, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

Таблица 1 — Влияние циклоспорина А на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени

Показатели скорости дыхания и синтеза АТФ

Контроль

Циклоспорин А

(10 мкМ)

J2 (нмоль О2/мин на 1 мг белка)

J3 (нмоль О2/мин на 1 мг белка)

J4 (нмоль О2/мин на 1 мг белка)

Ju, (нмоль О2/мин на 1 мг белка)

Jр (нмоль ADP / мин на 1 мг белка)

RC (отн. ед.)

ADP/O (отн. ед.)

10,5 ± 0,7

53,8 ± 1,6

12,0 ± 0,9

79,6 ± 1,8

196,3 ± 2,5

4,44 ± 0,28

1,83 ± 0,04

9,6 ± 0,7

43,9 ± 2,7*

11,0 ± 1,5

74,5 ± 5,4

160,3 ± 11,5*

4,15 ± 0,31

1,83 ± 0,03

Примечание. Условия опыта, состав среды инкубации и размерность применяемых величин приведены в разделе «Материалы и методы» и на рис. 4. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 4).

* Различия между опытом (присутствие циклоспорина А) и контролем (его отсутствие) статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

3.2. Действие циклоспорина А в различных концентрациях на стимулированное пальмитиновой и лауриновой кислотами дыхание митохондрий печени

На рис. 2 приведены данные сравнительных исследований разобщающего действия пальмитиновой кислоты в концентрации 30 мкМ при температуре 25ºС и 37ºС. Как видно из и рис. 2 пальмитиновая кислота в концентрации 30 мкМ стимулирует дыхание митохондрий приблизительно в равной степени (в 2,7 раза) как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС. Последующее добавление карбоксиатрактилата и глутамата приводит к частичному ингибированию дыхания, что свидетельствует об их способности подавлять разобщающее действие жирных кислот, т.е. о ресопрягающем действии (Samartsev et al., 1997a; 1997b; Самарцев и др., 2011). Добавление циклоспорина А в концентрации 10 мкМ после глутамата приводит к полному подавлению разобщающего действия пальмитиновой кислоты как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС (рис. 2).

Для количественной оценки степени участия ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных применялись величины ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата) соответственно (Samartsev et al., 1997b; Самарцев и др., 1999). Установлено, что ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата, глутамата и циклоспорина А одинаковы как при температуре 25ºС, так и при температуре 37ºС. все последующие эксперименты были проведены при температуре 25ºС.

Рис. 2. Влияние карбоксиатрактилата, глутамата и циклоспорина А на стимулируемое пальмитиновой кислотой дыхание митохондрий печени при температурах 25ºС (а) и 37ºС (б). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части. Мит – митохондрии печени (1 мг/мл), Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Глу – 2 мМ глутамата калия, ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

В следующих экспериментах (таблица 2) циклоспорин А был внесен в ячейку сразу после добавления митохондрий. Как видно из таблицы, если в отсутствии циклоспорина А пальмитиновая кислота в концентрации 30 мкМ стимулирует дыхание митохондрий в 2,36 раза, то в присутствии – в 2,09 раза. При этом в присутствии циклоспорина А карбоксиатрактилат и глутамат способны полностью подавлять стимулированное пальмитиновой кислотой дыхание (таблица 2).

Таблица 2 ─ Ингибирование карбоксиатрактилатом и аспартатом стимулированного пальмитатом дыхания митохондрий печени крыс в отсутствии (контроль) и присутствии циклоспорина А

Добавки

Скорость дыхания, нмоль О2/мин на 1 мг белка

Контроль (n = 4)

Циклоспорин А (n = 4)

Без добавок

Пал

Пал + Катр

Пал + Катр + Асп

Пал + Катр + Асп + ДНФ

11,1 ± 0,5

25,3 ± 1,2

19,1 ± 0,6

13,9 ± 0,4

78,2 ± 3,6

10,9 ± 0,4

22,6 ± 1,1

16,3 ± 0,5*

11,2 ± 0,4*

77,6 ± 3,4

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и на рис. 5. Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп – 3 мМ аспартата калия, 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.

* Различия между опытом (присутствие циклоспорина А) и контролем (его отсутствие) статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Циклоспорин А существенно уменьшает разобщающую активность пальмитиновой кислоты, но при этом не влияет на составляющие разобщающей активности чувствительную к карбоксиатрактилату и чувствительную к аспартату. Следовательно, действие циклоспорина А не связано с его влиянием на ADP/ATP- и аспартат/глутаматный антипортеры.

Циклоспорин А существенно уменьшает разобщающую активность лауриновой кислоты, но при этом не влияет на составляющие разобщающей активности чувствительную к карбоксиатрактилату и чувствительную к глутамату. Следовательно, и при разобщении лауриновой кислотой действие циклоспорина А не связано с его влиянием на ADP/ATP- и аспартат/глутаматный антипортеры.

По аналогии с карбоксиатрактилатом и глутаматом способность циклоспорина А ингибировать разобщающее действие лауриновой кислоты также была выражена количественно как ресопрягающий эффект. При добавлении циклоспорина А после лауриновой кислоты, карбоксиатрактилата и глутамата его ресопрягающий эффект составляет 26,1 ± 1,0 % (n = 4), в отсутствие карбоксиатрактилата и глутамата – 27,0 ± 1,6 % (n = 4). Карбоксиатрактилат и глутамат не влияют на составляющую разобщающей активности, чувствительную к циклоспорину А (JCsA).

На рис. 3 приведены результаты исследования зависимости ресопрягающего эффекта циклоспорина А от его концентрации. Как видно из рисунка 3, в низкой концентрации 0,5 и 1 мкМ циклоспорин А неэффективен и его ресопрягающий эффект проявляется только в концентрации 2 мкМ и выше, т.е. в существенно больше чем та, в которой он эффективно ингибирует кальций-зависимую неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий (Halestrap and Davidson, 1990; McGuinness et al., 1990; Andreeva and Crompton, 1994).

Рис. 3. Зависимость ресопрягающего эффекта циклоспорина А от его концентрации при разобщении митохондрий печени лауриновой кислотой в концентрации 30 мкМ. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и в примечании к таблице 3. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 4).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что циклоспорин А ингибирует разобщающее действие пальмитиновой и лауриновой кислот как в присутствии, так и в отсутствие карбоксиатрактилата и глутамата. Очевидно, что наряду с ADP/АТР- и аспартат/глутаматным антипортерами существует третий, чувствительный к циклоспорину А, путь разобщающего действия жирных кислот, функционирующий независимо от первых двух. Установлено, что ресопрягающий эффект циклоспорина А проявляется в концентрации, которая значительно больше той, в которой он эффективно ингибирует кальций-зависимую неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий. По-видимому, способность циклоспорина А ингибировать разобщающее действие жирных кислот не связана с его специфическим взаимодействием с циклофилином D.

3.3. Влияние циклоспорина А на разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий печени

Опыты с измерением разности электрических потенциалов (ΔΨ) на внутренней мембране митохондрий с помощью ТФФ-селективного электрода нередко проводятся в присутствии нигерицина, который, как известно, способен превращать ΔрН в ΔΨ (Скулачев, 1989; Samartsev et al., 1997а; 2000). Это необходимо для устранения возможных артефактов, связанных с изменением ΔΨ в присутствии пальмитиновой и лауриновой кислот. Концентрация применяемого в настоящей работе нигерицина 20 нМ является оптимальной, поскольку дальнейшее её увеличение не приводит к повышению ΔΨ (Samartsev et al., 1997; 2000). Установлено, что в этой концентрации нигерицин уменьшает ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата, но увеличивает ресопрягающий эффект циклоспорина А. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что вызванное нигерицином превращение ΔрН в ΔΨ приводит к ингибированию разобщающей активности пальмитиновой кислоты при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров и одновременно к увеличению разобщающей активности этой жирной кислоты при участии структуры, чувствительной к циклоспорину А.

Как видно из рисунка 4, добавление нигерицина к митохондриям приводит к повышению ΔΨ, а последующее добавление пальмитиновой кислоты – к снижению ΔΨ. Добавление карбоксиатрактилата и глутамата приводит к повышению ΔΨ (ресопрягающий эффект), что хорошо согласуется с известными данными (Samartsev et al., 1997a). Совместное ресопрягающее действие карбоксиатрактилата и глутамата приводит к полному восстановлению ΔΨ, в этом случае циклоспорин А обладает слабым эффектом на ΔΨ (рис. 4).

Рис. 4. Влияние карбоксиатрактилата (Катр), глутамата (Глу) и циклоспорина А (ЦсА) на ΔΨ митохондрий печени в присутствии нигерицина (Ниг) и пальмитиновой кислоты (Пал). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и в примечании к таблице 4. Среда инкубации была дополнена 1,6 мкМ хлоридом тетрафенилфосфония (ТФФ).

В отсутствии нигерицина внесение циклоспорина А к митохондриям после лауриновой кислоты приводит к снижению ΔΨ. Аналогичным образом действует циклоспорин А на ΔΨ и в отсутствии жирных кислот. Полученные результаты свидетельствуют о том, что циклоспорин А не только не повышает ΔΨ, как следовало бы ожидать исходя из его действия на дыхание митохондрий печени как ресопрягающего агента, но даже понижает этот потенциал.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в митохондриях печени разобщающее действие жирных кислот полностью подавляется при совместном действии карбоксиатрактилата, аспартата (или глутамата) и циклоспорина А. В отличие от карбоксиатрактилата и глутамата, циклоспорин А в указанной выше концентрации не влияет на мембранный потенциал митохондрий в присутствии жирных кислот. Полученные результаты позволяют предположить, что стимуляция дыхания митохондрий печени жирными кислотами обусловлена, помимо их протонофорного действия при участии ADP/АТР-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера, еще и активацией транспорта электронов по дыхательной цепи без снижения мембранного потенциала. Такой механизм активации свободного окисления в митохондриях известен под названием «внутреннее разобщение комплексов дыхательной цепи» (Van Dam et al., 1990; Papa et al., 2006).

3.4. Действие циклоспорина А на стимулированное α,ω-тетрадекандиоловой кислотой дыхание митохондрий печени

Известно, что α,ω-тетрадекандиоловая кислота (ТДК) стимулирует дыхание митохондрий печени без снижения мембранного потенциала, в то время как карбоксиатрактилат и глутамат не влияют на дыхание (Маркова и др., 1999). Как видно из рис. 5 (кривая а ), ТДК в концентрации 400 мкМ увеличивает скорость дыхания митохондрий печени почти в 2 раза. Последующее добавление к митохондриям циклоспорина А в концентрации 10 мкМ приводит к ингибированию дыхания до исходного уровня. В том случае, если циклоспорин А был добавлен к митохондриям в начальный момент их инкубации, стимуляции дыхания ТДК не наблюдалось (кривая б). Эти данные получены при стандартной для биохимических исследований температуре 25°С. Аналогичные результаты получены при температуре 37°С (кривые в и г). Во всех случаях последующее добавление протонофорного разобщителя 2,4-динитрофенола в оптимальной концентрации 50 мкМ приводит к стимуляции дыхания приблизительно в 7 раз (рис. 5). Полученные результаты подтверждают известные ранее данные о способности ТДК активировать свободное окисление в митохондриях печени (Маркова и др., 1999). Новым является то, что стимулирующее действие этой жирной кислоты практически полностью устраняется циклоспорином А.

Рис. 5. Сравнение действия на дыхание митохондрий печени циклоспорина А при добавлении его до (кривые а и в) и после (кривые б и г) ТДК при температуре 25°C (кривые а и б) и 37°C (кривые в и г). Условия опыта и состав среды инкубации описаны в разделе «Материалы и методы». Мит – митохондрии (1 мг/мл); ЦсА – циклоспорин А, 10 мкМ; ТДК, 400 мкМ; ДНФ – 2,4-динитрофенол, 50 мкМ. Цифры у кривых – скорость потребления кислорода, нмоль О2 / мин на 1 мг белка.

ТДК в концентрации 400 мкМ не влияет на дыхание митохондрий в состоянии 3 и в разобщенном состоянии, но увеличивает скорость дыхания в состоянии 2 – на 68% и в состоянии 4 – на 84%. При этих условиях ТДК существенно уменьшает коэффициент дыхательного контроля, но не влияет на скорость окислительного синтеза АТР и коэффициент ADP/O. Полученные данные свидетельствуют о том, что ТДК эффективно стимулирует дыхание митохондрий в отсутствие синтеза АТР, но в то же время не эффективна в активном метаболическом состоянии. Циклоспорин А в концентрации 10 мкМ не оказывает существенного влияния на дыхание митохондрий в состоянии 4 и в разобщенном состоянии, но на 18% ингибирует скорость дыхания в состоянии 3, что сопровождается снижением скорости окислительного синтеза АТР также на 18%. В присутствии циклоспорина А ТДК не влияет на исследуемые показатели дыхания и окислительного фосфорилирования.

Зависимость скорости дыхания митохондрий печени в состоянии 2 и в состоянии 4 от концентрации ТДК линейна. Это позволяет для характеристики активности ТДК использовать величину удельной активности (Va) и коэффициент активности α.

Как показали проведенные исследования, Pi не оказывает влияния на активность ТДК (таблица 3). Олигомицин, в концентрации полностью ингибирующей окислительное фосфорилирование, не изменяет активность ТДК как в отсутствии, так и в присутствии Pi (таблица 3). В присутствии олигомицина и Pi ADP также не влияет на активность ТДК (таблица 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемый эффект ТДК не связан с влиянием на F0F1-АТР-синтазу и отличается от действия мембранотропных разобщителей.

Таблица 3 ─ Удельная активность (Va) ТДК в митохондриях печени при различных экспериментальных условиях

Экспериментальные условия

Va , нМ О2/ мин на 1 мкМ ТДК

Без добавок (n = 6)

Олигомицин (n = 4)

Pi (состояние 2) (n = 5)

Pi (состояние 4) (n = 4)

Pi + АТР (n = 3)

Pi + олигомицин (n = 3)

Pi + олигомицин + ADP (n = 3)

14,9 ± 0,6

15,6 ± 0,4

16,8 ± 1,0

22,8 ± 0,4*

15,4 ± 0,4

16,1 ± 0,6

15,1 ± 0,5

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в разделе «Материалы и методы» и на рис. 5. Олигомицин, 2 мкг/мл; Pi, 5 мМ; АТР, 200 мкМ; ADP, 200 мкМ, Нигерицин 20 нМ. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 3 – 6).

* Различия между значеньями удельной активности ТДК в состоянии 2 и в состоянии 4 статистически значимы, р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Проведенные исследования также показали, что способность ТДК стимулировать дыхание обращается при последующем добавлении к митохондриям циклоспорина А в высокой концентрации (рис. 5 б и г). В пользу обратимости эффекта этой дикарбоновой кислоты свидетельствует и то, что стимуляция ТДК дыхания в состоянии 2 устраняется при добавлении к митохондриям ADP, т.е. при переходе их в состояние 3 и затем снова проявляется в состоянии 4. Исходя из этого, можно полагать, что стимуляция ТДК дыхания митохондрий без снижения мембранного потенциала не связана с нарушением этой дикарбоновой кислотой целостности внутренней мембраны, как это наблюдается при действии хлороформа (Chien and Brand, 1996).

Ранее уже отмечалось (Маркова и др., 1999), что действие ТДК на митохондрии похоже на действие десопрягающих агентов, которые, как полагают, переключают работу комплексов дыхательной цепи на холостой режим, или, говоря по-другому, осуществляют внутреннее разобщение (Van Dam et al., 1990; Papa et al., 2006). Проведенные в настоящей работе исследования, позволившие исключить другие известные пути стимуляции дыхания митохондрий, свидетельствуют в пользу такого механизма действия ТДК. Можно предположить, что циклоспорин А, будучи нейтральным липофильным соединением, но в то же время имея полярные группы, способен формировать водородные связи в гидрофобной области мембраны с полярными группами мембранных белков. Возможно, что подобным образом циклоспорин А затрудняет взаимодействие ТДК с сайтами комплексов дыхательной цепи и, вследствие этого, препятствует переводу их в холостой режим. Существует мнение, что внутреннее разобщение комплексов дыхательной цепи отсутствует в условиях окислительного синтеза АТР (Papa et al., 2006). Полученные в настоящей работе данные, показывающие отсутствие влияния ТДК на коэффициент ADP/O, вполне согласуются с этой точкой зрения.

Результаты проведенных исследований позволяют говорить о том, что имеется общее в механизме действия моно- и дикарбоновых жирных кислот. По-видимому, составляющая разобщающего действия монокарбоновых жирных кислот, чувствительная к циклоспорину А, и разобщающее действие α,ω-диоловых кислот осуществляется по одному и тому же механизму внутреннего разобщения. Обращает на себя внимание то, что циклоспорин А в концентрации 10 мкМ практически полностью подавляет часть разобщающей активности монокарбоновых жирных кислот, не связанной с функционированием ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, и разобщающую активность α,ω-дикарбоновых кислот. Следовательно циклоспорин А может быть использован как инструмент для оценки степени индуцированного этими моно- и α,ω-дикарбоновыми жирными кислотами внутреннего разобщения.

На рис. 6 приведена гипотетическая схема, объясняющая действие моно- и α,ω-дикарбоновых жирных кислот как индукторов внутреннего разобщения в митохондриях печени. Эта схема основывается на концепции локального сопряжения окислительного фосфорилирования в митохондриях (Yaguzhinsky et al., 2006; Papa et al., 2006). Согласно этой концепции, в течение окислительного синтеза АТР выбрасываемые комплексами дыхательной цепи протоны непосредственно передаются на комплекс F0F1-АТРсинтазу (рис 6, а). Часть протонов диффундирует в объемную водную фазу межмембранного пространства и возвращается обратно в матрикс путем пассивной утечки через внутреннюю мембрану. В этом случае монокарбоновые жирные кислоты могут усиливать пассивную утечку, действуя как разобщители-протонофоры при участии ADP/ATP- и аспартата/глутаматного антипортеров, в то время как α,ω-дикарбоновые кислоты не эффективны. Предполагается, что в отсутствии синтеза АТР протоны, минуя F0F1-АТР-синтазу, возвращаются обратно к комплексам дыхательной цепи (рис 6, б). Этот процесс, рассматриваемый нами как внутреннее разобщение окислительного фосфорилирования, значительно усиливается с помощью моно- и α,ω-дикарбоновых жирных кислот и подавляется циклоспорином А.

Рис. 6. Гипотетическая схема действия монокарбоновых жирных кислот (а) и α,ω-дикарбоновых жирных кислот (б) как индукторов внутреннего разобщения в митохондриях печени.

3.5. Исследование разобщающего действия пальмитиновой кислоты в митохондриях печени крыс различного возраста

Митохондрии печени месячных крысят массой 50 г. по сравнению с митохондриями печени взрослых крыс массой 250 г. имеют более высокую скорость дыхания как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты и это различие в наибольшей степени обусловлено за счет составляющей разобщающей активности не чувствительной к карбоксиатрактилату и глутамату (VIns) (Самарцев и др., 2004). Можно было бы полагать, что в митохондриях печени крысят составляющая разобщения VIns также будет полностью подавляться циклоспорином А. Однако нельзя исключить и то, что более высокие значения VIns в митохондриях печени крысят связаны с функционированием еще одной системы разобщения.

Как показано в таблице 4, скорость дыхания митохондрий печени месячных крысят как в контролируемом состоянии, так и в присутствии пальмитиновой кислоты превышает аналогичные показатели митохондрий печени взрослых крыс, что подтверждает опубликованные ранее данные (Самарцев и др., 2004). Разобщающее действие пальмитиновой кислоты в том и в другом случае эффективно подавляется карбоксиатрактилатом и аспартатом (таблица 6), что свидетельствует об участии в разобщении ADP/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров. Выше уже отмечалось, что полное подавление разобщающего действия пальмитиновой кислоты достигается при добавлении после карбоксиатрактилата и аспартата циклоспорина А. В митохондриях печени месячных крысят полное подавление разобщающего действие пальмитиновой кислоты также достигается при последующем добавлении циклоспорина А (таблица 6). Установлено, что в митохондриях печени месячных крысят ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата меньше, а циклоспорина А больше, чем в митохондриях печени взрослых крыс.

Таблица 4 ─ Сравнение скорости дыхания митохондрий печени крыс массой 250 г. и крысят массой 50 г. в присутствии пальмитата и при последующем добавлении карбоксиатрактилата, аспартата и циклоспорина А

Добавки

Скорость дыхания (нмоль О2/мин на 1мг белка)

Митохондрии крыс массой 250 г (n = 6)

Митохондрии крысят массой 50 г (n = 6)

Без добавок

Пал

Пал + Катр

Пал + Катр + Асп

Пал + Катр + Асп + ЦсА

Пал + Катр + Асп + ЦсА+ДНФ

10,8 ± 0,3

24,3 ± 0,8

18,2 ± 0,8

13,4 ± 0,5

10,8 ± 0,3

77,6 ± 3,3

15,1 ± 0,9*

35,5 ± 1,9*

27,7 ± 1,2*

22,4 ± 1,2*

15,1 ± 0,9*

76,9 ± 3,1

Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части и на рис. 23. Пал – 30 мкМ пальмитиновой кислоты, Катр – 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп – 3 мМ аспартата калия, ЦсА – 10 мкМ циклоспорина А, ДНФ – 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.



Страницы: 1 | 2 | Весь текст