Физико-химические свойства и структурные особенности белков сухо

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ АЛЕКСЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВ СУХОЙ ПШЕНИЧНОЙ КЛЕЙКОВИНЫ С ОГРАНИЧЕННОЙ СТЕПЕНЬЮ ПРОТЕОЛИЗА

Специальность ─ 03.00.04 ─ «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственныйуниверситет пищевых производств» на кафедре «Органическая и пищевая химия»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

– доктор технических наук, профессор

Колпакова Валентина Васильевна

– доктор биологических наук, профессор

Топунов Алексей Федорович

– доктор технических наук, профессор

Иунихина Вера Сергеевна

Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия им. А.К. Тимирязева

Защита диссертации состоится «22» декабря 2009 г. в 14.00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.07 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, ауд. 302, корп. А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП

Автореферат разослан «___» ноября 2009 г.

Ученый секретарь Совета

д.т.н., ст. н. с. Богатырева Т.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из основных направлений производства пищевых продуктов является интенсификация процессов их приготовления с одновременным приданием комплекса свойств, отвечающих требованиям науки о питании. В качестве приоритетных используются технологии получения и применения растительных белковых препаратов, однако свойства последних иногда не удовлетворяют требованиям потребителей, что сдерживает их применение.

Несмотря на то, что сухая пшеничная клейковина (СПК) довольно широко применяется в производстве хлеба, области её использования могут быть расширены за счет модификации свойств. Выбор СПК обуславливался тем, что пшеница является одной из традиционных культур для производства хлеба и тем, что для расширения и улучшения сырьевой базы растительного белка подобные разработки востребованы и для производства других видов пищевых продуктов.

СПК традиционно применяется в качестве улучшителя свойств муки, однако с помощью модификации ее белков можно изменять не только техно — функциональные свойства, но и обеспечивать эффективное ресурсосбережение за счет экономии сырья при использовании его в уменьшенных количествах и создании композиций с улучшенным аминокислотным составом.

Энзиматическое расщепление белкового комплекса СПК, биохимические характеристики гидролизатов и их функциональные свойства, определяющие пригодность препарата к использованию в различных пищевых продуктах, изучены не достаточно. В литературе полностью отсутствуют сведения о физико-химических свойствах белковых гидролизатов СПК разного качества, полученных с различными видами протеиназ, с одновременным анализом их функциональных свойств. Такие данные необходимы для целенаправленного регулирования свойств белков с целью эффективного применения и расширения направлений использования СПК в различных отраслях пищевой промышленности.

Изучение биохимических характеристик белков гидролизованной СПК и обоснование способов направленной модификации является актуальным, оно имеет теоретическое и практическое значение для управления процессами переработки зерна пшеницы, так и для биохимии растений в целом.

Работа проводилась в рамках Государственных контрактов НИР «Расширение и развитие совместного учебно-научного центра МГУПП и Института биохимии им. А.Н. Баха РАН с целью подготовки высококвалифицированных специалистов в различных областях биотехнологии» (2007-2009гг) и «Экологически безопасные ресурсосберегающие процессы получения, модификации, применения и сохранения качества пищевой белоксодержащей продукции из различных видов сельскохозяйственного сырья, включая некондиционное и отходы», заключенных с Федеральным Агентством по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось изучение биохимического процесса модификации СПК разного качества с ограниченной степенью протеолиза, предназначенной для использования в качестве улучшителя хлебопекарных свойств пшеничной муки и обогащения хлеба белком с улучшенным аминокислотным составом.

В задачи исследований входило:

– определение техно-функциональных свойств и химического состава СПК разного качества;

– исследование параметров гидролиза СПК разного качества с эндо- и экзопротеиназами;

– определение степени гидролиза сухой пшеничной клейковины;

– исследование молекулярно-весового распределения полипептидов гидролизатов СПК разного качества;

– изучение фракционного состава гидролизованных белков клейковины;

– исследование растворимости и межмолекулярных взаимодействий белков;

– изучение агрегирующей способности и гидрофобных свойств белков;

– исследование влияния активаторов и ингибиторов на активность протеиназ;

– использование гидролизованной клейковины для улучшения хлебопекарных свойств пшеничной муки и обогащения хлеба белком;

– определение функциональных свойств гидролизованной СПК;

– разработка рекомендации и проектов нормативной документации для получения и применения гидролизованной СПК.

Научная новизна. Впервые проведена сравнительная оценка ферментативного гидролиза СПК экзо-, и эндопротеиназными препаратами и показано, что чем крепче клейковина, тем больше аминного азота образуется под действием эндопротеиназ (Neutrase 1,5 MG®

, Portamex®倠), чем слабее, тем больше выделяется азота с экзопротеиназой (Flavourzyme 500 MG®倠).

Научно обоснованы параметры протеолиза с учетом особенностей качества СПК.

Показано, что степень гидролиза белков слабой клейковины с экзопротеиназой выше (2,86-3,41%), чем степень гидролиза короткорвущейся (1,7-2,9%) и хорошей (1,4-2,57%) СПК в присутствии эндопротеиназы. Чем слабее клейковина, тем больше образуется в ней белков, растворимых в солях, спирте и уксусной кислоте, содержащей детергент ЦТАБ.

При степени гидролиза белков 1,2-3,4% под действием эндо- и экзопротеиназ гидролизу подвергается как растворимая, так и нерастворимая глютениновая фракции клейковины с образованием белков альбуминового, глобулинового и глиадинового типов.

Выявлены различия во фракционном составе гидролизованной СПК в зависимости от ее качества. Фракционный состав белков короткорвущейся СПК отличался от состава белков слабой и хорошей клейковины большим количеством альбуминов, глобулинов и меньшим количеством глиадина, что аналогично фракционному составу сырой короткорвущейся клейковины зерна, выращенного при неблагоприятной погоде (сыройя и влажная).

Белки гидролизатов отличались от белков немодифицированной СПК более «рыхлой» структурой, содержащей на 25-37% больше белков, соединенных между собой нековалентными взаимодействиями. Среди них в структуре гидролизованных белков большая роль отводится ионным, меньшая – водородным и гидрофобным.

Улучшение хлебопекарных свойств пшеничной муки высшего сорта наблюдалось с использованием гидролизатов СПК со степенью протеолиза 1,40-2,18%, характеризующейся присутствием многоцепочечных белков, содержащих в своем составе ВМ одноцепочечные компоненты с М.М. 100, 108, 110 кДа.

Практическая значимость. Разработан способ гидролиза СПК разного качества, направленный на расширение возможностей ее применения в качестве улучшителя и для обогащения хлеба из муки пшеничной высшего сорта. Определены технологические параметры (температура, влажность, рН, время, концентрация эндо- и экзоферментных препаратов и СПК) для ограниченной степени протеолиза слабой, хорошей и короткорвущейся клейковины (1,4 – 2,9%) и предложен способ остановки гидролиза эндопротеиназы препарата Protamex® цитратом кальция.

Разработаны технологические режимы применения гидролизованной СПК (дозировки – 0,09 — 0,18%, время брожения теста – 120 мин) для достижения эффекта улучшения показателей качества формового и подового хлеба с одновременным сокращением времени созревания теста на 30 мин. Показана целесообразность применения композиции из гидролизованной СПК и амарантовой муки, взятых в дозировках 0,09 — 0,21% и 5-25% к массе муки, соответственно, для выработки хлеба, обогащенного на 20 – 93% белком, лизином, треонином, триптофаном со скором 75 -100% и кальцием до содержания 27,5-56,8 мг/100 г хлеба.

Проведена опытно-промышленная апробация способа приготовления пшеничного хлеба в ОАО «Звездный» и ЗАО «Коломенское». Разработаны проекты ТУ и ТИ на СПК гидролизованную, ТИ на производство хлеба пшеничного «Богатырь» и Рекомендации по получению и применению гидролизованной СПК в хлебопекарной и кондитерской промышленности.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на V юбилейной школе-конференции с Международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2007, 2008 г.), на VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008 г.); на IX Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008 г.), на VI Международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2008 г.); представлялись на VІ Международной научной конференции студентов и аспирантов «Техника и технология пищевых производств» (Могилев 2008, 2009 г.), на IX Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнология» (Казань 2008 г.) на Научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития технологии производства продуктов питания» (Воронеж, 2008г.)., по итогам докладов и выставок получено 2 диплома и 3 сертификата.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 15 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка использованных источников и 5 приложений. Основной текст работы изложен на 161 страницах, включает 32 рисунка и 30 таблиц. Список использованных источников включает 186 российских и зарубежных авторов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы приведены сведения о роли растительного белка в питании человека, охарактеризована пшеница как важнейший сырьевой источник белка. Обобщены сведения, относящиеся к способам производства, химическому составу и функциональным свойствам СПК. Дана характеристика физико-химическим свойствам и структурным особенностям белков клейковины разного качества, описаны способы модификации растительных белков, включая биохимические с применением различных типов ферментативных препаратов.

Приведена оценка эффективности использования биотехнологической ферментативной модификации для интенсификации технологических процессов, экономии сырьевых ресурсов, повышения качества и улучшения биологической ценности пищевых продуктов. Полученные сведения послужили основой для постановки задач по регулированию свойств клейковины с применением различных типов протеиназ для более эффективного её применения.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проведены на кафедрах «Органическая и пищевая химия» и «Технология хлебопекарного и макаронного производств» ГОУ ВПО МГУПП. Структурная схема исследований представлена на рисунке 1.

SHAPE \* MERGEFORMAT

Рисунок 1 – Структурная схема исследований

2.1 Материалы и методы исследования

В качестве материала использовались 11 образцов СПК, полученных с предприятия — «БМ» (Казахстан), имеющих сертификаты качества, эндопротеиназные ферментные препараты Neutrase 1,5 MG, Protamex и экзопротеиназа Flavourzyme 500 MG (Novozymes, Дания) с величиной активности 105, 125, 85 Е/г, соответственно, мука пшеничная хлебопекарная высшего сорта — ГОСТ Р 52189-2003, муку из амаранта — ТУ 9293-0095268-4947-06, дрожжи прессованные — ГОСТ 171-81, соль поваренная — ГОСТ Р- 51574-2000, вода питьевая — СанПиН 2.1.4.559-96, масло подсолнечное рафинированное (ГОСТ 1129-73).

Массовую долю влаги в препаратах определяли по ГОСТ 9793-74, массовую долю общего белка — по методу Кьельдаля на анализаторе белка/азота (BUCHI K-424) (Щвейцария), растворимого – методом Лоури, содержание аминного азота — методом формольного титрования. Массовая доля жира определялась в экстракторе/анализаторе жира Fex IKA (Германия) с гексаном, зольность − ускоренным методом сухого озоления. Протеолитическую активность определяли по методу Ансона в модификации А. Рухлядевой. Фракционный состав белков изучали последовательным экстрагированием по схеме: 0,5 моль/дм3 раствор NaCl → 70% раствор С2Н5ОН → 0,1 моль/дм3 раствор СН3СООН. Вклад нековалентных взаимодействий в структуру гидролизатов изучали методом последовательного воздействия растворителей, разрывающих те или иные связи, с учетом выделения относительного количества белка, выраженного в процентах (А. Б. Вакар).

Агрегирующую способность белков определяли на спектрофотометре ССП- 715 при длине волны 350 нм. Степень гидролиза измерялась в % по отношению к общему количеству аминного азота при полном гидролизе белка с 6н НСl.

Полипептидный состав белков исследовали методов электрофореза в 10% ПААГ и градиенте 10-20% ПААГ с ДДС-Na (рН 6,8). Для расчета молекулярных масс белков использовали метчики фирмы «Serva» (ФРГ). Содержание белка определяли по методу Бромхола. Техно-функциональные свойства регенерированной СПК определяли по методикам кафедры, ВСС, ЖСС, ЖЭС, ПОС, СП и растворимость – по методикам, опубликованным в работе В. В. Колпаковой и А. П. Нечаева (1995).

Тесто для хлеба готовилось безопарным способом, структурно-механические свойства мякиша хлеба определялись на приборе «Структурометр СТ-1М», показатели качества теста и хлеба оценивались стандартными и общепринятыми методами (Л. И. Пучкова, 2004). Процесс газообразования изучался методом измерения давления водяного столба под влиянием СО2 (dP/dt) (В. Я. Черных, 2006г). Для обработки результатов использован математический метод 2-х факторного планирования эксперимента с программами Matematica и Table Curve.

2.2 Результаты и их обсуждение

Техно-функциональные свойства и химический состав СПК разного качества. Исследовано 11 образцов сырой регенерированной СПК и выявлены отличительные особенности их органолептических и техно-функциональных свойств. Образцы условно объединены в 3 группы, в основу характеристики которых положены значения показателя упругой деформации сырой клейковины (Ндеф). Обобщенная характеристика групп СПК приведена в таблице 1.

От каждой группы СПК отобраны по 1 образцу короткорвущейся, хорошей и

слабой клейковины со значениями Ндеф 40, 65 и 80 ед. приб, соответственно. Показатели химического состава удовлетворяли требованиям Codex Alimentarius.

Таблица 1 – Техно-функциональные свойства сырой регенерированной СПК

№ групп,

№ бразцов

Ндеф.,ед. приб.

Выход, %

Гидратационная способность, %

Общая характеристика

І 1-4

40 — 50

202 — 204

154 — 165

Крепкая,

короткорвущаяся

ІІ 5-8

54 — 75

207 — 238

153 — 175

Хорошая

ІІІ 9-11

78 — 83

230 — 248

176 — 180

Удовлетворительно слабая

Массовая доля белка составляла 75,6 — 81,1%, зависимости свойств СПК от химического состава образцов при этом не обнаружено.

Определение параметров гидролиза СПК разного качества осуществлялось с использованием 2-х эндо- и 1-го экзопротеиназного препаратов. Для контроля процесса гидролиза предварительно отработана методика определения аминного азота методом формольного титрования с измерением рН. Переменными факторами выступали концентрация ферментного препарата, концентрация СПК, время гидролиза белков, рН и температура действия ферментов.

На рисунках 1, 2 приведены результаты влияния концентрации хорошей СПК в диапазоне от 23 до 90% и влияние температуры в интервале от 20 до 60°С, при различном времени гидролиза, с экзопрепаратом Neutrase 1,5 MG (дозировка 0,3 Е/г белка) на содержание аминного азота. Показано, что наибольшее его количество выделялось при концентрации клейковины 37% и температуре 50°С за время гидролиза 90 – 150 мин.

EMBED Excel.Chart.8 \s

EMBED Excel.Chart.8 \s

Рисунок 1 – Влияние концентрации и времени гидролиза на содержание аминного азота. СПК,%: 1 — 90, 2 — 85, 3 — 80, 4 — 75, 5 — 47, 6 — 44, 7 — 42, 8 — 37, 9 — 25, 10 — 23

Рисунок 2 — Влияние температуры и времени гидролиза на содержание аминного азота. Температура,°С: 1 — 20, 2 — 30, 3 — 40, 4 — 50, 5 – 60

Наиболее эффективным значением рН для действия данного фермента явилось 6,0 – 6,5 при времени гидролиза 40 — 90 мин (рисунок 3).

EMBED Excel.Chart.8 \s

Рисунок 3 – Влияние рН на содержание аминного азота; рН: 1 — 4,0; 2 — 5,0; 3 — 5,5; 4 – 6,0; 5 — 6,5; 6 — 7,0; 7 — 8,0.

Исследование влияния концентрации ФП в диапазоне от 0,1 до 1,0 Е/г белка, при описанных выше параметрах, на содержание аминного азота показало, что с повышением концентрации ФП количество азота повышалось и максимально составляло 700 мг % при концентрации 1,0 Е/г белка (рисунок 4). Количество его, по сравнению с контролем, увеличивалось в 6-7 раз, время гидролиза — 30 – 60 мин.

EMBED Excel.Chart.8 \s

Рисунок 4 – Влияние концентрации Neutrase 1,5 MG на содержание аминного азота, Е/г белка: 1 — 0,1; 2 — 0,2; 3 — 0,3; 4 — 0,4; 5 — 0,5; 6 — 0,6; 7 — 0,7; 8 — 0,8; 9 — 0,9; 10 — 1,0.

В таблице 2 сведены значения всех параметров гидролиза СПК, необходимые для максимального накопления аминного азота, при концентрациях 0,3; 0,6; 1,0 Е/г белка.

Таблица 2 – Параметры протеолиза СПК (Neutrase 1,5 MG)

Концентрация препарата, Е/г

Влажность,

%

рН

Температура,

°С

Время

гидролиза,

мин

Аминный азот, мг%

0,3

63,0

6,8-7,0

50,0

90

540

0,6

63,0

6,8-70

50,0

60

610

1,0

63,0

6,8-7,0

50,0

40

700

Диапазон данных параметров использован далее для определения оптимальных параметров гидролиза СПК с другим эндопротеазным препаратом Protamex с использованием метода математического планирования. Факторами служили: время (Х) и температура (Y), функциями (Z) – аминный азот. Опыты проводились при рН 6,5-6,8 (Const) для 3-х концентраций ФП 0,3; 0,6; 1,0 Е/г.

В результате получено уравнение для прогнозирования количества аминного азота в зависимости от исследуемых факторов (рисунок 5).

А

Б

Z = 467, 0789+43, 6057*X — 0, 6967*X * X+0, 4726*X*Y+0, 207 *Y* Y

Рисунок 5 – Зависимость количества аминного азота от температуры и времени гидролиза СПК ( А — концентрация 0,3 Е/г; Б — концентрация 1,0 Е/г)

Обработка данных в компьютерных программах Matematika и Table Curve позволили получить для СПК хорошего качества оптимальные параметры гидролиза для точек экстремума максимума аминного азота (таблица 3).

Таблица 3 – Оптимальные параметры гидролиза СПК (Protamex)

Концентрация фермента, Е/г

Температура, °С

Время гидролиза, мин

рН

Аминный азот, мг %

0,3

50,0

48,6

6,5

575

0,6

50,6

48,8

6,5

581

1,0

50,0

50,0

6,5

628

При концентрации ФП 1,0 Е/г, по сравнению с концентраций 0,3 Е/г, количество аминного азота больше выделялось всего на 8,5%, при 0,3 и 0,6 Е/г оно почти одинаково, поэтому сделан предварительный вывод, что для практических целей экономичнее использовать дозировку 0,3 Е/г.

Аналогично получены оптимальные параметры гидролиза СПК хорошего качества и для ФП Flavourzyme 500 MG при различных концентрациях: рН — 6,5, температура – 50°С, время, в зависимости от концентраций 0,3, 0,6, 1,0 Е/г, – 55; 43; 28 мин, соответственно.

Таким образом, для ферментативной модификации СПК хорошего качества под влиянием эндо-, и экзопротеиназы определены параметры протеолиза.

Установленные значения параметров применены для модификации и двух других образцов СПК при различных концентрациях ферментов (рисунок 6) и

Neutrase 1,5 MG

Protamex

Flavozyme 500 MG

Рисунок 6 — Зависимость количества аминного азота от деформации сжатия клейковины

показано, что чем крепче клейковина, тем больше образовывалось аминного азота под влиянием Neutrase 1,5 MG и Protamex. Чем слабее, тем больше образовывалось аминного азота с экзопротеиназой Flavozyme 500 MG. Данная закономерность обнаружена для всех 3-х концентраций ФП.

На следующем этапе при оптимальных значениях влажности, рН, температуры для всех 3-х концентраций ФП препаратов эндо — (Neutrase 1,5 MG, Protamex) и экзопротеиназного действия (Flavozyme 500 MG) уточнено время гидролиза СПК с учетом накопления 400 мг% аминного азота (таблица 4), характерного для всех дозировок – 0,3; 0,6; 1,0 Е/г.

Определение степени гидролиза белков, которая колебалась от 1,5 до 3,4%, показало, что она несколько выше с ФП Protamex, чем с Neutrase 1,5 MG. У слабой клейковины степень гидролиза СПК была больше в присутствии экзопротеиназы, а у короткорвущейся – в присутствии эндопротеиназ. Глубина

Таблица 4 – Время гидролитического расщепления СПК разного качества



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст