Фенотип иммунокомпетентных клеток больных первично-операбельным

На правах рукописи

СКОТАРЕНКО ЛИДИЯ ВИКТОРОВНА

Фенотип иммунокомпетентных клеток больных первично-операбельным раком молочной железы.

Специальность: 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА

2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (директор-академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Воротников Игорь Константинович

доктор медицинских наук, профессор

Кадагидзе Заира Григорьевна

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Караулов Александр Викторович

доктор медицинских наук, профессор

Петерсон Сергей Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Защита диссертации состоится «____» __________ 2012 г. в_____часов на заседании Диссертационного Совета (Д.001.017.01) при ФГБУ «Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина» РАМН

по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Автореферат разослан «__» ______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор медицинских наук, профессор Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) на протяжении последних десятилетий занимает лидирующие позиции среди злокачественных новообразований женского населения. Количество заболевших в России составляет 38.2 на 100000 населения.

В настоящее время ключевая роль в иммунологической защите организма от опухоли отводится Т-клеткам. Т-клетки, специфические в отношении опухоле-ассоциированных антигенов (ОАА), обнаруживаются как в крови, так и непосредственно в опухолевой ткани, что является доказательством того, что иммунная система способна распознавать опухоль. В то же время, в подавляющем большинстве случаев иммунологический ответ на ОАА не приводит к регрессии опухоли, а результаты иммунотерапевтических методов, как правило, очень скромные. Опухоль обладает различными механизмами преодоления иммунологического надзора, а иммунная система способна как поражать опухолевые клетки, так и содействовать их росту. Изучение иммунологических изменений при раке молочной железы выявило, что нарушения иммунного ответа наиболее четко выявляются лишь при распространении опухолевого процесса. В настоящее время установлено, что важную роль не только в индукции ауто-толерантности, но и в индукции толерантности к опухолевым клеткам играет немногочисленная популяция регуляторных (супрессорных) СD4+ T-клеток, которые предупреждают развитие различных органо-специфических аутоиммунных поражений, а также способны эффективно подавлять противоопухолевый ответ.

К настоящему времени накоплен огромный материал, свидетельствующий о том, что различные субпопуляции регуляторных Т-клеток: CD4+, CD8+, а также NKT клетки играют существенную роль в контроле аутоиммунных процессов, а также иммунного ответа на аллотрансплантаты, аллергены, инфекционные агенты и опухолевые клетки. Важно отметить, что различные субпопуляции Т-супрессоров экспрессируют разные рецепторы, используют разные эффекторные механизмы и функционируют на разных стадиях иммунного ответа.

С другой стороны не менее важной является оценка функциональной состоятельности цитотоксических клеток. Известно, что популяция эффекторных лимфоцитов гетерогенна и содержит, как Т-лимфоциты (CD3+CD8+), так и NK клетки (CD3CD16+). Основной функцией киллерных клеток является выявление и удаление клеток собственного организма, имеющих отклонения от нормы (опухолевые, вирус инфицированные и т.д.). В отличие от эффекторных Т-лимфоцитов, NK-клетки опосредуют цитотоксические реакции без предварительной сенсибилизации. Показано, что гетерогенными являются не только популяции цитотоксических клеток, но и механизмы цитолиза, используемые ими. Более того, одни и те же эффекторные лимфоциты способны использовать несколько различных механизмов. В настоящее время известно несколько систем реализации цитотоксической функции лимфоцитами. Одним из основных путей является экзоцитоз литических гранул – перфорина и гранзимов.

Исследованиями последних лет показано, что при наличии опухолевого процесса значительно увеличивается число минорных супрессорных популяций и снижается потенциал цитотоксических лимфоцитов. Представляет интерес оценить связь иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови больных раком молочный железы с экспрессией опухолевых маркеров.

Цель исследования:

Изучить особенности иммунологических показателей больных первично-операбельным раком молочной железы.

Задачи исследования:

Определить уровень сывороточных опухолевых маркеров (CA-125, РЭА, СА-15.3) периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы.

Оценить линейную структуру лимфоцитов периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы.

Оценить субпопуляции эффекторных лимфоцитов (NK и NKT) периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы.

Определить минорные субпопуляции регуляторных лимфоцитов (CD45+CD4+CD25+CD127+, CD45+CD8+CD28) периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы.

Научная новизна:

Впервые обнаружено увеличение цитотоксического потенциала Т-лимфоцитов у больных с 1 и 2 стадией рака молочной железы, указывающее на активное функционирование противоопухолевого иммунного ответа на ранних стадиях заболевания. Впервые выявлена обратная зависимость процентного содержания двух популяций супрессорных клеток NKT (CD45+CD3+CD16+CD56+) и Т-клеток CD45+CD8+CD28 периферической крови в зависимости от стадии заболевания, что указывает на активацию супрессорного звена иммунитета при развивающемся опухолевом процессе.

Практическая значимость:

Полученные данные могут быть использованы при разработке новых схем лекарственного лечения больных первично-операбельным раком молочной железы.

Апробация работы:

Апробация диссертационной работы состоялась 24 января 2012 г. на совместной научной конференции НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН отделений: опухолей молочных желез, диагностическое, опухолей женской репродуктивной системы, реконструктивной и сосудистой хирургии, радиохирургии, отделение изучения новых противоопухолевых лекарственных препаратов, лабораторий клинической иммунологии опухолей, иммунологии гемопоэза, кафедр онкологии Первого Московского Государственного Медицинского Университета им. И.И. Сеченова, Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета, Российской медицинской академии последипломного образования.

Материалы диссертации доложены на VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (г.Душанбе, 2010 г.), XIV Российском онкологическом конгрессе (г.Москва, 2010г.), конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (г.Нижний-Новгород, 2010г.), XV Российском онкологическом конгрессе (г. Москва. 2011г.).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи, 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 21 источник отечественной и 140 источников зарубежной литературы. Текст иллюстрирован 22 таблицами и 24 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение клеток из цельной крови на градиенте плотности фиколл-верографин.

Выделение мононуклеарной фракции клеток периферической крови проводили в градиенте плотности фиколл-верографин. Гепаринизированную кровь разводили в 2 раза PBS и осторожно наслаивали на раствор фиколла в следующих соотношениях: 3 объема разведенной крови на 1 объем фиколла и центрифугировали при 1500 об/мин (30 мин) при комнатной температуре. Мононуклеарные клетки собирали из интерфазы автоматической пипеткой. Клетки отмывали первый раз PBS (20 мин) при 1500 об/мин, а затем еще 2 раза по 10 мин при 1000 об/мин при комнатной температуре.

Прямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции.

Для проведения прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали МКА, меченные FITC, PE, PE-Cy5, PC5. 5х105 клеток на один образец (МКА) инкубировали с 10 или 20 мкл МКА в течение 30 мин при 4оС, затем клетки дважды отмывали центрифугированием при 1000 об/мин при комнатной температуре в 2,0 мл PBS. Осадок ресуспендировали в 200 мкл фиксирующего раствора BD CellFIX и анализировали методом проточной цитофлуориметрии (Табл. 1).

Двухцветная и трехцветная реакции поверхностной иммунофлюоресценции.

Клетки в количестве 5х105 помещали в пробирки BD Falcon 12×75 mm и инкубировали с МКА, конъюгированными флуорохромами (или FITC, или PE, или PE Cy5, или РС5) в течение 30 минут при 4оС, после чего клетки отмывали в 2,0 мл PBS. Окрашивание осуществляли с помощью коктейля антител, при этом каждое МКА вносили в пробирку по 10 мкл. В случае использования немеченных МКА, окрашивание клеток проводили в три этапа. Сначала клетки окрашивали немеченными МКА, после 30-минутной инкубации и двух отмывок в зависимости от изотипа первых МКА к клеткам добавляли 20 мкл соответствующей изотип-специфической сыворотки, меченной FITC или PE. После 30-минутной инкубации и двух отмывок клетки докрашивались коктейлем МКА, прямомеченных FITC, PE или PerCP в течение 30 минут при 4оС. Затем клетки дважды отмывали в 1,0 мл PBS и фиксировали в 200 мкл фиксирующего раствора BD CellFIX. Субпопуляционный многопараметровый анализ поверхностных антигенов осуществляли с применением метода проточной цитофлуориметрии.

Таблица 1.

Специфичность моноклональных антител используемых в работе

Кластер дифференцировки (CD), антиген

Клетки-мишени

CD3

Зрелые Т-лимфоциты

CD4

Субпопуляция Т-лимфоцитов

CD8

Субпопуляция Т-лимфоцитов, субпопуляция NK-клеток

CD19

В-лимфоциты

CD16

Субпопуляция NK-клеток

CD56

Субпопуляция NK-клеток

HLA-Dr (антиген

гистосовместимости II класса)

Активированные Т-лимфоциты, В-лимфоциты

CD25

Активированные Т лимфоциты, регуляторные клетки

CD28

Наивные Т-лимфоциты, Т хелперы

CD38

Активированные Т-лимфоциты

CD127

Регуляторные клетки

CD45

Все лейкоциты

CD14

Моноциты

Проточно-цитофлуориметрический анализ.

Методом предпочтения в научно-практической работе современной клинико-иммунологической лаборатории сегодня является проточная цитофлуориметрия (ПЦ). Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на 5-ти параметровых проточном цитофлуориметре аналитического типа FACSCalibur (серийный № Е1402) производства компании «Becton Dickinson» (CШA), укомплектованном воздухо-охлаждаемым аргоновым лазером (длина волны возбуждения — 488 нм). Сбор и анализ материала проводили с использованием коммерческого программного обеспечения BD CellQuest PRO software.

Выделение «гейтов» клеток для анализа осуществляли в двухмерной системе координат – цитограмме или DotPlot по линейным (lin/lin) параметрам прямого и углового светорассеяния (FSC vs SSC) с целью удаления мелких (дебрис) и крупных (агрегаты) частиц, а также в смешанных линейно-логарифмических (lin/log) режимах (SSC vs FL1, FL2, FL3) или только с применением параметров флуоресценции с логарифмическим усилением сигнала (log/log). В зависимости от цели анализа, в каждом образце проводили сбор от 5 000 до 10 000 клеток.

Иммунофенотипирование лимфоцитов.

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом многопараметрового цитометрического анализа до и через 2 недели после хирургического лечения с использованием коммерческих наборов моноклональных антител, конъюгированных FITC, PE, PE-Cy5, PC5 (BD Biosciences, Bekman Coulter). Использовали следующие двух- и трехцветные реагенты: СD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD19, CD3/CD16+56, CD3/HLA-Dr, CD4/CD25, CD4/CD127/CD25, CD8/CD28, CD8/CD38, CD8/CD16. (таблица 2)

Таблица 2.

Субпопуляции лимфоцитов, исследованные в работе у больных первично-операбельным раком молочной железы.

Антиген

Специфичность

CD3+/CD4+

Т-хелперы

CD3+/CD8+

Цитотоксические Т-лимфоциты

CD3-/CD8+

Субпопуляция NK-клеток

CD3-/CD16+CD56+

NK-клетки

CD8+/CD16+

Субпопуляция NK-клеток

CD3-/CD16+CD56+

NKT-клетки

CD3+/HLA-Dr+

Активированные Т-лимфоциты

CD4+/CD25+

Активированные CD4+ лимфоциты

CD8+/CD38+

Активированные CD8+ лимфоциты

CD8+/CD28-

Регуляторные клетки

CD4+/CD127+/CD25+

Регуляторные Т-лимфоциты

CD8+/CD28+

Наивные Т-лимфоциты

CD3-/CD19+

В-лимфоциты

В качестве контрольных образцов использовали периферическую кровь 30 практически здоровых женщин в возрасте от 25 до 58 лет. Многопараметровый количественный цитометрический анализ проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences). В каждом образце накапливали и анализировали не менее 5000 событий в гейте CD45+/CD14 лимфоцитов. количество клеток с фенотипом CD45+/CD14 составляло не менее 95-97%. Использовали Dotplot анализ, учитывали относительное число позитивных клеток (%). Для дискриминации неспецифического связывания использовали конъюгат IgG1FITC/IgG2aPE, IgG1FITC/IgG2aPE/IgG2a PC5, IgG1FITC/IgG2aPE/IgG2a PerCP (Рис.1).

Рис.1. Фенотип лимфоцитов периферической крови.

Определение цитотоксического потенциала клеток-эффекторов.

Цитотоксический потенциал клеток-эффекторов изучали с использованием коммерческой тест-системы, содержащей моноклональные антитела к внутриклеточному белку перфорину (BD Biosciences). Применяли комбинированное окрашивание поверхностных антигенов в сочетании с окрашиванием внутриклеточного белка CD8/Perforin, CD16/Perforin. Для субпопуляционного анализа экспрессии внутриклеточных белков использовали метод одновременного окрашивания поверхностных антигенов в сочетании с окрашиванием внутриклеточных маркеров. Клетки в количестве 5х105 помещали в пробирки BD Falcon clear polystyrene test tubes 12×75 mm и инкубировали с МКА, конъюгированными флуорохромами (или FITC, или PE, или PE Cy5) в течение 15 минут при 4оС, после чего добавляли по 100 мкл FIX&PERM раствора А и продолжали инкубацию еще 15 минут при тех же условиях. После этого клетки отмывали в 2,0 мл PBS, затем вносили МКА к внутриклеточным белкам по 10 мкл и по 100 мкл FIX&PERM раствора В. После 20-ти минутной инкубации клетки отмывали в 2,0 мл PBS и фиксировали в 300 мкл фиксирующего раствора BD CellFIX. Анализировали готовые образцы методом проточной цитофлуориметрии.

Измерение уровней опухолевых маркеров проводили с использованием диагностических тест-систем производства Hoffmann-La Roche на автоматическом анализаторе ELECSYS 2010. В основе метода используется иммуно-электрохемилюминесцентный анализ.

Опухолевые маркеры (ОМ) – СА-15.3, раковоэмбриональный антиген (РЭА) и СА-125 определяли у 73 больных на старте лечения.

Статистическая обработка данных.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения “Sigma Plot 11.0” for Windows. Достоверность различий в исследовании оценивали по t-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона-Манна-Уитни и Фишера в зависимости от характера распределения значений выборки. Для выявления различий в частоте распределения нормальных и измененных величин отдельных показателей в сравниваемых группах использовали критерий χ2. Различия считали достоверными при Р<0,05. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В основу работы положено исследование периферической крови 73 больных первично-операбельных раком молочной железы находившихся на обследовании и лечении в хирургическом отделении опухолей молочных желез ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН с 2009 по 2010г., а так же проведен анализ иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови онкологических больных до и после хирургического лечения. Так же был исследован уровень сывороточных маркеров (СА-125, РЭА, СА-15,3) у всех обследованных больных до начала лечения.

В наше исследование вошли женщины в возрасте от 30 до 81 года. Средний возраст больных составил 56.8 лет.

Наиболее часто был диагностирован рак левой молочной железы — 38 случаев (52,1%), рак правой молочной железы выявлен в 35 случаях (47,9%)

У больных первично-операбельным раком молочной железы в 56 (76,7%) случаях выполнялись радикальные мастэктомии с сохранением обеих грудных мышц и удалением 3 уровней подмышечной клетчатки, у 17 (23,3%) больных были произведены радикальные резекции с обязательной лучевой терапией в послеоперационном периоде.

До хирургического лечения с первой стадией заболевания было 15 (20,5%) пациенток, со 2а стадией 22 (30,1%) пациентки и со 2б стадией 36( 49,3%). Диагноз был установлен на основании клинико-рентгенологических методов исследования.

После хирургического лечения с 1-й стадией 24 (32,9%) пациентки, со 2а стадией 24 (32,9%) пациентки, со 2 б стадией 14 (19,2%) и с 3 а стадией 11 (15.1%) пациентки. Диагноз был поставлен после планового гистологического исследования.

В работе также определялся уровень сывороточных опухолевых маркеров (ОМ) – РЭА, СA-15.3 и СA-125. В настоящем исследовании исходные показатели одного или нескольких маркеров были повышены лишь у 13 пациенток, причем 8 из них имели 3 стадию заболевания. Таким образом, доля пациенток с повышенными опухолевыми маркерами составляла всего 18% от общего числа обследованных больных.

Рис.2.Распределение больных по уровню опухолевых маркеров

При исследовании Т-клеточной популяции особое внимание уделяется CD4+ и CD8+ субпопуляциям и их соотношению CD4+/CD8+ (иммунорегуляторный индекс — ИРИ). Как известно, при норме 1,2-2,4 у большинства онкологических больных ИРИ уменьшается относительно показателей здоровых доноров. В нашем исследовании было обнаружено статистически значимое снижение количества CD45+CD3+CD4+ Т лимфоцитов (35,7±1,0 по сравнению с контролем 43,4±1,6) и незначительное повышение числа CD45+CD3+CD8+ Т-клеток, что привело к снижению ИРИ. При анализе общей популяции CD45+CD8+ отмечалось повышение содержания этих клеток, которое происходило за счет эффекторных лимфоцитов с фенотипом CD45+CD3CD8+. Оперативное лечение практически не влияло на исследованные показатели (Табл.3).

Полученные данные указывают на особую клиническую значимость показателей соотношения CD4/CD8 для оценки функционирования иммунной системы. Аналогичные данные широко обсуждаются в литературе, где этот показатель учитывается как для обеспечения адекватного индивидуализированного курса лечебных мероприятий, так и прогноза заболевания.

Исследование эффекторных цитотоксических клеток проводилось с помощью многопараметровых иммунологических исследований, позволяющих выявить их фенотипическую гетерогенность. Оценивалось количество как эффекторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD45+CD3+CD8+, так и NK-клеток с фенотипом CD45+CD3CD16+CD56+. Из литературных данных известно, что последняя популяция имеет также фенотип CD45+CD8+CD16+, а анализ этих клеток выявил, что их количество достоверно выше у обследованных больных. Возможно, что увеличение количества этих клеток является компенсаторной реакцией иммунной системы на развивающийся опухолевый процесс.

Таблица 3

Субпуляции Т лимфоцитов периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы до и после хирургического лечения (% антиген-положительных клеток).

Маркер

До операции

(n=73)

(M± m)

После операции

(n=73)

(M± m)

Доноры

(n=30)

(M±m)

CD3+

67,5±1,4

68,5±1,5

73,8± 1,5

CD3+CD4+

35,7±1,0*

37,4±1,3*

43,4± 1,6

CD3+CD8+

25,7±1,0

25,0±1,0

26,9± 1,1

CD3CD8+

13,6±1,0*

12,8±0,9*

7,7± 0,6

CD8+

39,3±1,1*

37,8±1,0

34,6± 1,4

CD3-CD16+CD56+

19,5±1,0

19,1±1,2

16,7± 1,3



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст