Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го ти

На правах рукописи

ЧЕРНЫШОВА Ирина Николаевна

ФЕНОМЕНОЛОГИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА

НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сидорова Екатерина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Нагиева Фирая Галиевна

ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН

заведующая лабораторией гибридных клеточных культур

доктор биологических наук Данилова Татьяна Абрамовна

ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России

ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции иммунитета

Ведущая организация:

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина»

РАМН

Защита состоится 17 мая 2012г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН

Автореферат разослан «26» марта 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Антигены (АГ) подразделяются на тимус-зависимые (ТЗ) и тимус-независимые (ТН) АГ. В свою очередь, ТН АГ делятся на антигены 1-го (ТН-1) и 2-го (ТН-2) типов. ТН-1 АГ, например липополисахариды (ЛПС), обладают митогенной активностью и индуцируют образование иммуноглобулинов (ИГ) любыми В клетками. В низких дозах ТН-1 АГ ведут себя как «обычные» иммуногены и стимулируют В клетки со специфическими ИГ-рецепторами [Coutinho A. et al, 1974; Poe W.J. et al, 1976].

ТН-2 АГ представляют собой гетерогенную группу соединений. К ним относятся многие бактериальные полисахариды, полимеризованный флагеллин, АГ-компоненты некоторых вирусов, а также синтетические АГ – поливинилпироллидон (ПВП), полипептиды из D-аминокислот, конъюгаты гаптенов с ТН-носителями и др. В отличие от ТН-1 АГ митогенной активностью они не обладают [Mond J.J. et al, 1995; Сидорова Е.В, 2002].

Ответ на ТН-2 АГ не рестриктирован по МНС, хотя Т клетки и Т-факторы могут на него влиять [Mond J.J. et al, 1995; Jeurissen A. et al, 2004]. АТ, образующиеся в ходе ответа на ТН-2 АГ, в основном относятся к IgM изотипу, хотя в некоторых случаях образуются АТ IgG и IgA классов [Snapper C.M. et al, 1992; Fagarasan S et al, 2000; McKisis M.D. et al, 2000].

Молекулярные и клеточные механизмы образования АТ к ТН-2 АГ до сих пор до конца не выяснены; мало данных о феноменологии иммунного ответа, не изучены взаимодействия В клеток, отвечающих на ТН-2 АГ, с другими клеточными популяциями, не установлен механизм переключения синтеза ИГ с IgM на IgG и IgA изотипы и т.д. Ответы на эти и другие вопросы имеют не только теоретическое, но и практическое значение. ТН-2 АГ входят в состав многих бактерий и некоторые вирусов, вызывающих ряд опасных заболеваний (менингиты, пневмонии, грипп и др.). ТН-ответ на них – «первая линия» защиты организма от инфекции. Поэтому изучение иммунного ответа на ТН-2 АГ может оказаться полезными для разработки подходов к конструированию вакцина основе ТН-2 АГ. Все это говорит об актуальности настоящего исследования.

Цель исследования: изучение феноменологии и механизмов гуморального иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ.

Задачи исследования

1. Разработать методы выявления клеток, продуцирующих АТ и тотальные ИГ, при иммунизации мышей ТН-2 АГ.

2. Определить зависимость иммунного ответа от дозы, времени и природы ТН-2 АГ in vivo.

3. Сравнить иммунный ответ мышей на ТЗ, ТН-1 и ТН-2 АГ in vivo.

5. Выяснить роль различных субпопуляций В клеток мыши (Lyb5+, Lyb5– и CD5+) в иммунном ответе на ТН-2 АГ in vivo и in vitro.

Научная новизна

Разработаны методы выявления единичных клеток селезенки мыши, образующих АТ к ТН-2 АГ.

Охарактеризована феноменология иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ.

Впервые показано, что иммунизация мышей ТН-2 АГ приводит к увеличению числа В клеток, образующих не реагирующие с антигеном неспецифические/ поликлональные ИГ.

Впервые продемонстрировано, что одновременное введение мышам ТЗ и ТН-2 АГ вызывает суммацию числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из антигенов в отдельности. В отличие от этого одновременное введение двух ТН-2 АГ к суммации числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из антигенов, не приводит.

Разработана оригинальная схема получения поликлональной сыворотки мышей, специфичной к Lyb5.2 антигену зрелых В лимфоцитов мыши.

Впервые показано, что в образовании неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, как и в образовании специфических АОК, основная роль принадлежит зрелым В клеткам мыши; при этом основное количество антител и неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, продуцируется CD5+ В-1 клетками.

Практическая значимость

Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера. В ней использованы оригинальные методические подходы, позволяющие оценивать роль разных субпопуляций В лимфоцитов мыши в иммунном ответе на ТН-2 АГ. Получены новые данные, расширяющие представления о механизмах развития гуморального иммунного ответа на ТН-2 АГ. Поскольку значительная часть бактериальных и часть вирусных антигенов относится к ТН-2 АГ, в защите от которых основную роль играют В-1 лимфоциты, изучение механизмов их активации ТН-2 АГ может быть полезным для разработки подходов к созданию вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту

Иммунизация мышей ТН-2 АГ вызывает появление АТ-продуцентов (АОК), и увеличивает число продуцентов тотальных ИГ (ИГОК). В результате возрастает число В лимфоцитов, образующих индуцируемые антигеном неспецифические ИГ, не реагирующие с введенным антигеном.

Совместное введение мышам ТЗ и ТН-2 АГ вызывает появление АОК к обоим антигенам и суммацию числа клеток, продуцирующих неспецифические ИГ, индуцированные каждым из введенных антигенов.

Совместное введение мышам двух ТН-2 АГ вызывает образование АОК к каждому из них, но не приводит к суммации числа клеток, продуцирующих индуцированные антигенами неспецифические ИГ.

При иммунизации мышей ТН-2 АГ за образование АТ и неспецифических ИГ отвечают зрелые Lyb5+ В лимфоциты. Основное количество антител и неспецифических ИГ, индуцированных ТН-2 АГ, образуют CD5+ B-1 лимфоциты.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002; 2005), Международных иммунологических конгрессах (Монреаль, Канада, 2004; Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2007), Европейском иммунологическом конгрессе (Париж, Франция, 2006), Международных иммунологических конференциях (Бостон, США, 2008; Сан-Франциско, США, 2009; Осака, Япония, 2010).

Апробация диссертации состоялась 29.02.2012г. года на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 8 в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 в иностранных изданиях.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 131 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Библиография включает 172 отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. В опытах использовали самок мышей линий BALB/c, DBA/2, CBA весом 16-18 г и xid-мышей линии CBA/N. В качестве комплемента использовали сыворотку морских свинок. Антисыворотки, специфичные к ИГ мыши, получали от кроликов. Используемые в работе эритроциты выделяли из крови баранов.

Антигены. В качестве ТЗ АГ использовали: а) эритроциты барана, б) водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), полученный по методу (Seman M. et al, 1972), в) инактивированный вирус гриппа штамм A/PR8/34 (H1N1), (НИИВС РАМН, Москва). В качестве TH-1 АГ использовали ЛПС E. coli 055:В5 (Sigma), а в качестве ТН-2 АГ – полисахарид пневмококка типа III (SIII), любезно предоставленный проф. J. Humphrey (Англия), α (1→3) декстран (Декс) Leuconostoc mesenteroides, полученный от д-ра М.Е. Преображенской, за что приносим ей глубокую благодарность, фиколл 400 (Фик) (Pharmacia) и синтетический полимер – поливинилпирролидон с мол.массой 350 кДа (ПВП) (Serva). Кроме того использовали конъюгат динитрофенила с фиколлом (ДНФ-Фик), полученный по методу (Inman J.K., 1975).

Сыворотки, антисыворотки, антитела, конъюгаты, магнитные бусы. Для постановки иммунохимических реакций использовали: сыворотки интактных и иммунизированных мышей разных линий, кроличью антисыворотку, специфичную к μ-цепям IgM мыши. В качестве АТ использовали афинно очищенные АТ козы к ИГ мыши (IgM+IgG+IgA) (ICN). Пероксидазный конъюгат АТ барана к IgG кролика синтезирован в лаборатории.

Для разделения спленоцитов на Т и В клетки использовали моноклональные анти-Thy 1.2 АТ, полученные из гибридомы к Thy 1.2, любезно предоставленной д-р. Червонским А.В.; моноклональные АТ (монАТ) крысы к CD5 АГ лимфоцитов мыши, выделенные из супернатанта гибридомы 53.7.8., любезно предоставленной проф. L. Herzenberg (Stanford University, USA); АТ мыши против CD5.2 АГ мыши (Caltag); цитотоксические АТ мыши против CD5 (Ly1.2) АГ мыши (Cedarlane). Для иммуномагнитной сепарации клеток использовали магнитные бусы к pan T маркеру лимфоцитов мыши и бусы, сенсибилизированные АТ барана против IgG крысы или АТ козы против IgG мыши (Dynal, Norway).

Приготовление магнитных бус, сенсибилизированных антителами к CD 5 антигену спленоцитов мыши. Для сенсибилизации магнитных бус М450 использовали монАТ мыши (Caltag) или монАТ крысы к CD5 АГ мыши. Обработку бус АТ проводили согласно протоколу (Dynal).

Для удаления CD5+ В клеток были приготовлены 3 типа магнитных бус: 1) бусы M450, покрытые монАТ мыши или крысы к CD5 АГ мыши; 2) бусы, сенсибилизированные АТ козы против IgG мыши и покрытые затем анти-CD5 АТ мыши; 3) бусы, покрытые сначала АТ козы к IgG крысы, а затем монАТ крысы против CD5 АГ мыши. Наиболее эффективными для удаления CD5+ В клеток оказались последние магнитные бусы.

Иммуномагнитная сепарация спленоцитов мыши. Для удаления CD5+B клеток из суспензии спленоцитов мыши использовали два подхода. В первом случае CD5+ В клетки удаляли с помощью магнитных бус, покрытых анти-CD5 АТ. Во втором случае спленоциты сначала обрабатывали анти-CD5 АТ крысы, а затем удаляли из суспензии CD5+ клетки с помощью магнитных бус, покрытых АТ к IgG крысы. В ряде случаев из суспензии спленоцитов сначала удаляли Т клетки с помощью pan T (Thy 1.2) магнитных бус. «Розетки» (клетка, присоединившая 3-5 бусин) осаждали на магните. Не связавшиеся с бусами клетки (обедненные по CD5+ лимфоцитам) использовали в функциональных тестах.

Индукция иммунного ответа in vivo и in vitro. Для индукции первичного иммунного ответа in vivo мышам BALB/c, CBA и CBA/N внутривенно вводили ПВП, SIII, Декс, Фик и ЛПС – 2 мкг/мышь, ДНФ-Фик и вирус гриппа A/PR8/34 – 5 мкг/мышь, ВРАБЭ – 500 мкг/мышь. В ряде опытов антигены в различных сочетаниях и в тех же концентрациях вводили попарно. Селезенку извлекали на 4 сутки после иммунизации и готовили моноклеточную суспензию.

Для индукции иммунного ответа in vitro по модифицированному методу [Michell R.J., Dutton R.W., 1967] в культуру спленоцитов добавляли иммуногенные концентрации антигенов: ВРАБЭ –50 мкг/мл, вирус гриппа А/РR8/34 – 5 мкг/мл, ПВП и ЛПС – 10 нг/мл, ДНФ-Фик – 30 нг/мл. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали и суспендировали в среде RPMI 1640.

О величине иммунного ответа судили по количеству IgM-АОК и IgM-ИГОК. Для их выявления использовали метод локального гемолиза в геле агарозы [Jerne N.K., 1963] с незначительными модификациями и клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT) [Moller S.A., Borrebaeck C.A., 1985] в модификации Логуновой Н.Н. (1986).

Число клеток, образующих неспецифические ИГ (НИГОК), рассчитывали по разности между количествами ИГОК и АОК; число НИГОК, индуцированных АГ (инНИГОК), определяли по разности между количествами НИГОК в суспензиях иммунных и нормальных спленоцитов. Результаты выражали в виде числа продуцентов АТ и ИГ в пересчете на млн спленоцитов.

Постановка реакции цитотоксичности. Микровариант реакции ставили в 96-луночных круглодонных плейтах. В лунки вносили равные объемы суспензии клеток-мишеней, антисывороток/АТ в различных разведениях и комплемент. Контролями служили пробы клеток, инкубируемых: а) с антисыворотками/АТ без комплемента, б) с комплементом без АТ, и в) просто в среде. По окончании инкубации определяли жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего. Цитотоксический индекс (ЦИ) вычисляли по формуле:

ЦИ = [(а – б)/(100 – б)] x 100, где а – процент мертвых клеток в лунках с антителами и комплементом, б – процент мертвых клеток в лунках с комплементом.

Макровариант реакции ставили в пробирках и использовали для: 1) удаления Т клеток с помощью анти-Thy монАТ, 2) удаления Lyb+5 В лимфоцитов с помощью анти-Lyb5.2 антисыворотки и 3) удаления CD5+ B спленоцитов с помощью цитотоксических анти-CD5 АТ мыши. К спленоцитам (после удаления эритроцитов) добавляли соответствующие АТ и комплемент в подобранных заранее разведениях, инкубировали клетки час при +370С и определяли ЦИ. Затем клетки отмывали средой RPMI 1640 и определяли в клеточных суспензиях количества АОК и ИГОК.

Статистическая обработка результатов. Данные представлены в виде М±m, где М – среднее арифметическое, m – стандартное отклонение. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью t-критерия Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первая часть работы была направлена на изучение феноменологии иммунного ответа мышей на ТН-2 АГ.

Динамика иммунного ответа на ТН-2 антигены. Мышам BALB/c вводили SIII или ПВП (2 мкг/мышь) и на разные сроки после иммунизации в суспензии спленоцитов определяли количества АОК и ИГОК методом локального гемолиза в геле агарозы и рассчитывали число НИГОК.

Однократное введение ТН-2 АГ индуцировало появление АОК, рост числа ИГОК и НИГОК и появление НИГОК, индуцированных этими АГ (инНИГОК), т.е. вызывало и специфическую, и неспецифическую/ поликлональную активацию В лимфоцитов (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Динамика иммунного ответа на ПВП

Дни после

иммунизации

ПВП

Число продуцентов на 106 спленоцитов

АОК

ИГОК

НИГОК

инНИГОК

0

3 ± 2

680 ± 98

677 ± 97

0

3

33 ± 3

850 ± 126

817 ± 124

140 ± 28

4

88 ± 9

1271 ± 200

1183 ± 192

506 ± 95

5

41 ± 5

961 ± 132

920 ± 128

243 ± 32

7

10 ± 2

798 ± 123

788 ± 121

111 ± 25

10

4 ± 2

588 ± 82

584 ± 81

0

Таблица 2. Динамика иммунного ответа на SIII

Дни после

иммунизации

SIII

Число продуцентов на106 спленоцитов

АОК

ИГОК

НИГОК

инНИГОК

0

2 ± 1

1991 ± 185

1975 ± 184

0

3

17 ± 2

2585 ± 229

2568 ± 228

379 ± 86

4

99 ± 24

3107 ± 331

3008 ± 308

1019 ± 125

5

118 ± 29

2629 ± 308

2511 ± 280

522 ± 97

7

18 ± 4

2409 ± 264

2391 ± 201

402 ± 78

10

11 ± 3

1714 ± 152

1703 ± 150

0

В динамике появления АОК и ИГОК наблюдался четкий параллелизм: максимальное их количество достигалось на 4-5 сутки, затем снижалось и на 7-10 дни возвращалось к исходному уровню. Об уровне неспецифической стимуляции свидетельствует количество инНИГОК. Эти клетки появлялись (как и АОК) после введения и ПВП, и SIII, достигая максимума также к 4-му дню; затем их число постепенно снижалось, и на 10-й день выявить их вообще не удавалось. Это свидетельствует о том, что появление индуцированных НИГОК обусловлено введением ТН-2 АГ.

Динамика ответа на ТН-2 АГ оказалась в целом сходна с таковой при иммунизации животных ТЗ АГ [Агаджанян М.Г. и др, 1981], хотя амплитуда ответа на ТН-2 АГ была намного ниже.

Зависимость иммунного ответа от дозы введенных ТН-2 и ТЗ антигенов. Известно, что величина специфического ответа зависит от дозы введенного АГ. В то же время в опытах с ТЗ АГ было показано, что in vitro при высоких концентрациях антигена часть В лимфоцитов может связывать его неспецифически и активироваться таким способом [Bach M.A et al, 1983]. Для определения зависимости ответа от дозы ТН-2 АГ мышам BALB/c вводили от 10-2 до 1 мкг ПВП/мышь и для сравнения ТЗ-АГ – эритроциты барана в дозах 106 –5х108/мышь. На 4-е сутки определяли количества АОК и ИГОК методом локального гемолиза в геле агарозы и рассчитывали число НИГОК.

Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что увеличение дозы и ТЗ, и ТН-2 АГ приводит к пропорциональному увеличению количеств АОК и НИГОК, соответственно. Образование последних проявлялось в широком диапазоне доз ТН-2 АГ. Повышение числа НИГОК вызывало уже введение низких доз АГ; АОК выявлялись при более высоких концентрацияхТН-2 АГ. Таким образом, результаты, полученные при иммунизации мышей ТН-2 АГ, в принципе, не отличались от таковых при введении ТЗ АГ.

Таблица 3. Зависимость иммунного ответа от дозы введенного антигена

Антиген

Доза

антигена

Число АОК

на 106 спл.

Число НИГОК

на 106 спл.

Эритроциты



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст