Строение и состав продуктов экстракции и модификации биологическ

На правах рукописи

Борисенко Сергей Николаевич

СТРОЕНИЕ И СОСТАВ ПРОДУКТОВ ЭКСТРАКЦИИ И МОДИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СРЕДЕ СУБКРИТИЧЕСКОЙ ВОДЫ

02.00.04 – физическая химия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физической и органической химии Южного федерального университета

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

Харабаев Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор

Калабин Геннадий Александрович

доктор технических наук,

профессор

Кужаров Александр Сергеевич

Ведущая организация: Международный Томографический Центр СО РАН

Защита диссертации состоится 13 ноября 2009 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.14 при Южном федеральном университете по адресу: 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/2, НИИ ФОХ ЮФУ конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская 148).

Автореферат разослан 12 октября 2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор химических наук

А.С.Морковник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск экологически безопасных методов экстракции и химической модификации фармацевтически значимых соединений растительного происхождения является одним из приоритетных направлений современной химии. Замена токсичных органических растворителей экологически чистыми суб- и суперкритическими флюидами, такими как СО2 и вода, является наиболее перспективным подходом к решению поставленных задач. В последнее десятилетие, для экстракции и химической модификации биологически активных соединений предложено использовать субкритическую воду (перегретая вода под давлением при температурах от 100оС до 374оС). Для России, с ее богатейшими растительными ресурсами, возможность использования субкритической воды в технологических процессах является чрезвычайно актуальной и имеет огромное практическое значение, особенно с учетом экологической чистоты, доступности и дешевизны воды (по сравнению с традиционными токсичными и дорогостоящими органическими растворителями). Поэтому, исследования, нацеленные на разработку экологически чистых методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды, являются актуальными и имеют значительный инновационный потенциал.

Цель работы: разработка экологически чистых методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды и установление состава полученных продуктов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем и спектроскопии ЯМР.

В задачи исследований входило:

1) Разработка экологически чистых методик (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды биологически активных соединений растительного происхождения, имеющих значительный фармацевтический потенциал.

2) Установление строения и состава полученных продуктов с использованием физико-химических методов: спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем.

3) Сравнение эффективности методик с использованием субкритической воды для получения биологически активных биофлавоноидов и тритерпеновых гликозидов с результатами традиционных методов экстракции, основанных на применении органических растворителей в качестве экстрагента.

4) Изучение изомеризации изохинолинового алкалоида глауцина в фенантреновый природный алкалоид дес-глауцин.

5) Синтез в среде субкритической воды одного из интенсивно изучаемых макроциклов — циклотривератрилена.

Научная новизна. Впервые среда субкритической воды использована для экстракции биофлавоноидов кверцетина и дигидрокверцетина, а также для извлечения смеси аралозидов из аралии манчжурской – биологически активных соединений растительного происхождения, имеющих значительный фармацевтический потенциал, как в РФ, так и за рубежом. Осуществлена изомеризация природного алкалоида апорфинового ряда глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин в среде субкритической воды с выходом, в три раза превышающим лучший из описанных ранее в литературе результатов. Впервые в среде субкритической воды осуществлён синтез макроциклических соединений циклотривератрилена и циклотетравератрилена.

Практическая ценность работы. Продемонстрированы принципиальные преимущества использования субкритической воды (горячей воды под давлением) для извлечения биологически активных соединений класса биофлавоноидов и тритерпеновых гликозидов по сравнению с традиционными методами. Разработаны методы изучения строения продуктов и анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкритической воды, с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем.

Предложены экологически безопасные методики получения биологически активных биофлавоноидов в среде субкритической воды, обладающих широким спектром терапевтического действия (антиоксидантное, капилляроукрепляющее действие и др.), присущего как индивидуальным веществам из группы флавоноидов, так и их смесям, что позволяет создавать на их основе большое число лекарственных форм. Предлагаемые методики экстракции и синтеза в среде субкритической воды, как правило, более эффективны и экологически безопасны по сравнению с традиционными подходами, основанными на использовании дорогостоящих и токсичных органических растворителей. Предлагаемые подходы открывают возможности получения перспективных с фармакологической точки зрения соединений в экологически чистых реакционных средах. По материалам работы подано 4 заявки на изобретения.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Международной научно-практической конференции “Сверхкритические флюидные технологии: инновационный потенциал России”, (Ростов-на-Дону; 11-12 октября 2006); IX Международном Семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, экология) 15 – 20 сентября 2008 год; V Международной научно-технической конференции “Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ-2009”, (Севастополь, 21–25 апреля 2009); IV, V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (Ростов-на-Дону, 18-22 сентября 2007, 1 — 5 июня 2009), V Международной научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, 15–18 сентября 2009); V Ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН, (г. Ростов-на-Дону, 2009), III Всероссийской конференции «Аналитика России» (г. Краснодар, 27 сентября – 2 октября 2009 г.)

Работа выполнена при поддержке грантов Министерства образования и науки РФ (РНП 2.2.2.23915 и 2.1.1.4939), президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-363.2008.03) и Американского фонда гражданских исследований и развития (США) по Российско-американской программе “Фундаментальные исследования и высшее образование” (гранты CRDF BP3C04, BP4M04).

Частично полученные в работе результаты использовались для реализации проекта по программе Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере СТАРТ-06 (г/к 4366р/6813).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, включая 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и 11 работ в материалах и тезисах докладов Международных и Всероссийских конференций и семинаров.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка цитируемой литературы (209 наименований)

Работа изложена на 108 страницах, содержит 44 рисунков и 9 таблиц.

Во введении обосновывается актуальность диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1 диссертации содержит обзор литературы, где рассмотрены основные теоретические и экспериментальные данные по применению суб- и суперкритических флюидных сред для экстракции и модификации различных соединений. Отмечено, что вода, находящаяся в жидком субкритическом состоянии (при температурах выше 100 °С и ниже 374 °C и давлении, обеспечивающим нахождение воды в жидкой фазе), является весьма эффективным и экологически чистым инструментом экстракции и химической модификации биологически активных соединений, за счет возможности изменения ее физико-химических свойств (диэлектрической проницаемости, ионного произведения, диффузионных свойств и плотности) при увеличении давления и температуры.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экстракция биофлаваноидов

Экстракцию субкритической водой в проточном режиме проводили с помощью специально разработанной и изготовленной оригинальной установки (рис. 1).

Рис. 1 Блок — схема и фотография установки для экстракции биофлавоноидов субкритической водой: 1. Емкость для воды; 2. Насос; 3. Термостат; 4. Контур предварительного нагрева; 5. Картридж; 6. Рестриктор (ограничитель давления); 7. Емкость для сбора экстракта

С использованием разработанной установки изучена возможность экологически чистого способа выделения флавоноидов из растительного сырья на примере естественного антиоксиданта – кверцетина.

EMBED ISISServer EMBED ISISServer

Кверцетин I

Дигидрокверцетин II

В качестве сырья использовали горец перечный (Polygonum hydropiper L., спорыш). Экстракцию проводили перегретой водой (субкритической водой) при температуре до 250ºС и давлении 120 атм в течение 30 минут. Соответствующая хроматограмма смеси представлена на рис 2.

Рис. 2 Хроматограмма экстракта, полученного в среде субкритической воды из травы горца перечного(Polygonum hydropiper L.)

Для оценки эффективности предложенной экстракции в среде субкритической воды проведено сравнение с результатами экстракции, полученных традиционным метанольным методом извлечения флавоноидов. Результаты представлены в таблице № 1.

Таблица №1 Содержание флавоноидов и кверцетина в экстрактах горца перечного, полученных различными способами.

Способ экстракции

Сумма флавоноидов по площадям пиков, мB*108

Количество кверцетина I,

мкг/г

Относительная доля извлечения кверцетина

Метанол

5,8

43,1

1,0

Субкритическая вода

4,8

328,0

7,6

Установлено, что экстракция субкритической водой позволяет извлечь кверцетина в 7,6 раз больше по сравнению с традиционным способом. В то же время, общая сумма флавоноидов, регистрируемая в экстракте, полученном в субкритической воде, меньше, чем при традиционной метанольной экстракции. Для изучения причин такого поведения, экстракция в среде субкритической воды была осуществлена в нескольких температурных интервалах. Результаты исследований показали, что при температурах ниже 100 °С кверцетина извлекается столько же, сколько извлекается традиционной метанольной экстракцией (44,0 мкг/г),. При нагревании воды от 100ºС – до 150ºС извлекается 61,3 мкг/г , а в интервале от 150ºС до 250ºС извлекается дополнительно еще 222,7 мкг/г (рис. 3).

Рис. 3 Зависимость содержания кверцетина в смесях экстрактов горца перечного (Polygonum hydropiper L.), полученных различными способами

Следует предположить, что повышение температуры воды способствует высвобождению кверцетина, связанного в растительной матрице. В частности, это может быть результат реакции гидролиза присутствующих в растительной матрице гликозидов биофлаваноидов, таких, например, как рутин или его (кверцетина) другие гликозиды. Это косвенно подтверждается наблюдаемым в эксперименте уменьшением площадей хроматографических пиков флавоноидов при сравнении с результатами традиционной экстракции (Табл.1). Разработанная установка была использована для изучения процесса гидролиза рутина III (дигликозида образованного кверцетином и восстанавливающими сахарами глюкозой VI и рамнозой V) до кверцетина I в среде субкритической воды. Cхема реакции представлена на рисунке 4.

EMBED ISISServer

III

IV

V

EMBED ISISServer

I

V

VI

Рис. 4 Схема получения кверцетина I из рутина Ш в субкритической воде

Результаты хроматографии стандартного раствора рутина и экстракта, полученного на установке через 30 мин. приведены на рис. 5а и 5б соответственно.

а)

б)

Рис. 5 а) Хроматограмма рутина; б) хроматограмма смеси, полученной из рутина в среде субкритической воды

В отличие от хроматограммы стандартного раствора рутина, которая содержала один пик с временем выхода 7.7 мин. (Рис. 5), в смеси, полученной из рутина в среде субкритической воды, наблюдаются хроматографические пики с временами выхода от 6.18 до 7.75 и 9.32 мин, что может соответствовать смеси из двух и более соединений (пик 6.18 – 7.75 мин уширен). Для определения качественного состава смеси, с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением были исследованы компонентные составы соответствующих хроматографических пиков. Для пика (6.18 — 7.75 мин) при регистрации положительных ионов обнаружены ионы с m/z 303.2 (протонированный молекулярный ион кверцетина); 465.3 (протонированный молекулярный ион фрагментации рутина); 611.4 (протонированный молекулярный ион рутина) (рис.6). Аналогично, в масс-спектре отрицательно заряженных ионов наблюдается пик с m/z 609,3 (депротонированный молекулярный ион рутина), соответствующий рутину.

Рис. 6 Масс-спектры положительных (а) и отрицательных ионов (б), полученные для пика с временем выхода 7,22 мин

Для хроматографического пика 9,32 мин, при регистрации отрицательных ионов в масс-спектре наблюдаются только ионы с m/z 301.2 (депротонированный молекулярный ион кверцетина), соответствующие кверцетину. Что доказывает эффективность процессов гидролиза рутина в условия субкритической воды с образованием кверцетина, без применения кислотного катализатора, обычно используемого в этих случаях. Данный механизм может осуществляться и при экстракции кверцетина из растительного материала, что, вероятно, является причиной увеличения его выхода по сравнению с традиционной методикой. При этом масс-спектрометрия с ионизацией электроспреем позволяет установить наличие кверцетина в продукте. Необходимо отметить, что интервал температур 230 — 270 °С в области до критической точки соответствует максимальному ионному произведению воды, который выше на три порядка по сравнению с обычными условиями (температура 25ºС и давление 1 атм). Субкритическая вода при таких температурах демонстрирует свойства кислотного катализатора (А.А. Галкин, В.В Лунин// Успехи химии. — 2005. — 74. — С.24-40). Вероятно, поэтому, в большинстве изученных далее нами процессов экстракции и модификации оптимальным оказалось использование воды при температуре 250ºС.

Дальнейшее развитие предложенная экспериментальная процедура и установка получили при извлечении дигидрокверцетина из отходов древесины. Дигидрокверцетин (ДКВ) 3,3′,4′,5,7 – пентагидроксифлаванон (II) обладает широким спектром биологической активности: антиоксидантными, капилляропротекторными свойствами в сочетании с противовоспалительным, гастро- и гепатопротекторным, гиполипидемическим и диуретическим действием. ДКВ — действующее вещество препарата «Капилар»).

В настоящее время известно множество различных способов извлечения дигидрокверцетина из растительного сырья, основанных на извлечении ДКВ с помощью полярных органических растворителей (водно-ацетоновый раствор, метилтретбутиловый эфир, водно-спиртовый раствор, этилацетат) с последующей очисткой на сорбентах и перекристаллизацией. На этом этапе работы выполнена экстракция дигидрокверцетина субкритической водой в проточном режиме (рис.1). По окончании процесса полученный водный экстракт подвергали анализу на содержания ДКВ. Хроматограмма извлечения из древесины лиственницы субкритической водой в проточном режиме представлена на рисунке 7.

Рис. 7 Хроматограмма экстракции из древесины лиственницы субкритической водой в динамическом режиме (ДКВ – пик со временем удерживания 10,79 мин)

Для извлечения ДКВ субкритической водой в проточном режиме были подобраны оптимальные условия . Из полученных данных следует, что при температуре ниже 150 °С, а также свыше 190 °C выход дигидрокверцетина уменьшается в несколько раз. Это может быть объяснено тем, что при более низкой температуре вода слабее проявляет экстракционные свойства, а при более высокой происходит разрушение дигидрокверцетина. В результате исследований установлены оптимальные условия извлечения дигидрокверцетина в среде субкритической воды: температура 160-180ºС и давление 80,5-87,5 атм (выделение 2,73 г ДКВ из 1кг опилок). Для сравнения эффективности различных методов экстракции ДКВ представлены в таблице 2 (доля эффективности извлечения традиционным методом извлечения принята за 1).

Таблица 2. Эффективность различных методов экстракции ДКВ.

Способ экстракции

Условия

Количество ДКВ, мкг/г*

Доля

извлечения

1. Традиционная экстракция ацетоном

ацетон, 40°С

30 мин.

1916

1

2. Экстракция сверхкритическим CO2

350 атм, 70°С, 1 час

< 1

< 0,001

3. Экстракция субкритической водой в герметичном реакторе

150°C, 1 час

1045

0,55

4. Экстракция субкритической водой в проточных

условиях

160-180°С,

78-85 атм.

5 мин.

2731

1,4

* Количество параллельных определений n = 2-5

В результате исследований установлено, что экстракция субкритической водой в непрерывном режиме позволяет извлечь в 1,4 раза больше дигидрокверцетина, чем традиционным методом. Скорость процессов в закрытых системах всегда меньше в сравнении с проточными, поэтому извлечение в герметичном реакторе составило всего 56% от традиционной экстракции. В силу того, что суперкритический углекислый газ является неполярным растворителем, а дигидрокверцетин имеет в своем составе 5 полярных гидроксильных группировок, экстракция сверхкритическим СО2 оказалась, малоэффективна.

2. Экстракция тритерпеновых гликозидов — аралозидов в среде субкритической воды

Другим классом биологически активных соединений растительного происхождения, к которому был применен метод экстракции в среде субкритической воды, стали аралозиды, использованные в качестве модельных тритерпеновых гликозидов. Тритерпеновые гликозиды остаются классическими объектами исследования благодаря широкому спектру их биологической активности. В качестве модельного объекта в работе выбраны типичные представители гликозидов — биологически активные вещества из корней аралии маньчжурской Aralia mandshurica аралозиды А, В и С (на рис. 8 представлены гликозиды олеаноловой кислоты).

EMBED ISISServer

VI

Рис. 8 Структурные формулы аралозидов А (R1 = L-арабиноза, R2= Н), В (R1 = L-арабиноза, R2 = L-арабиноза) и С (R1 = D-галактоза, R2 = D-ксилоза)

Смеси этих аралозидов являются действующими веществами лекарственных средств «Настойка аралии» и «Сапарал», применяемых в качестве тонизирующего и иммунномодулирующего средства и близких по лечебному действию к препаратам женьшеня. Исходным продуктом для лекарственных средств из аралии является концентрат «Сапарал» (ФС 42-1924-82), представляющий собой аморфный порошок кремового цвета без запаха с содержанием смеси аралозидов А, В и С не менее 80 %. Агликон аралозидов –олеаноловая кислота является мощным антиоксидантом и проявляет противоопухолевую активность. Классическая схема экстракции для получения смеси аралозидов включает применение в качестве экстрагентов метанола, этилацетата, н-бутанола, активированного угля, соляной кислоты и гидроксида аммония, что приводит к необходимости регенерации и утилизации значительного количества растворителей и адсорбентов. В данной части работы задача состояла в разработке экологически чистой методики экстракции смесей аралозидов, в среде субкритической воды и эффективных методик установления состава полученных продуктов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Экстракция аралозидов из корней аралии в среде субкритической воды проведена в статическом режиме. В герметичный реактор емкостью 10 см3 из нержавеющей стали помещали навеску сухого средне измельченного корня аралии и добавляли выбранный объем воды; герметично закрытый реактор помещали в термостат при температуре 140±2 оС на 1 ч. Затем реактор охлаждали, осадок вместе с остатками корней отфильтровывали, водный фильтрат пропускали через хроматографическую колонку c оксидом алюминия для хроматографии. После упаривания с применением роторного испарителя получали сыпучий порошок коричневого цвета без запаха. Наличие и концентрация аралозидов А, В и С в полученных экстрактах определены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ВЭЖХ/МС) с ионизацией электроспреем. Классический экстракт аралозидов, используемый для сравнения, получен по литературной методике экстракцией метанолом. Так как выделение аралозидов проведено в форме солей аммония, то хроматограмма экстракта аралозидов содержит характерные изохронные группы пиков однозарядных катионов: М+H+, M+NH4+ , M+Na+ и M+K+, т.е. [М+1]+, [М+18]+, [М+23]+ и [М+39]+. Соединения с катионами, имеющими m/z 927, 944, и 949 идентифицированы как аралозид А (молекулярная масса (MМ) = 926), с m/z 1059 и 1097 – как аралозид В (ММ = 1058), с m/z 1089, 1106 и 1111 – как аралозид С (ММ = 1088) (Рис. 9). Относительное содержание аралозидов А, В и С определено методом нормировки и составило: А: В :С = 57 : 27 : 16.

Рис.9 Масс-спектр положительных ионов аралозида VIА.

С использованием разработанных методик идентификации хроматографических пиков процесс экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды был изучен и оптимизирован. В качестве параметров, влияющих на эффективность предложенного метода получения смеси аралозидов, были изучены влияние добавок аммиака, температуры, продолжительности экстракции и соотношения количеств сырья и экстрагента.

Таблица № 3 Сравнение результатов экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской (n = 6) различными методами (n = 6).

Метод экстракции

Экстрагент

Время, мин.

Температура, ОС

Выход аралозидов из 1 г сырья

Эффективность извлечения**

мг/г*

%*

Традиционный

Метанол

180

65

23,6±2,6

2,4

1

Субкритическая вода

Вода

60

140

30,1±4,5

2,9

1,3

Субкритическая вода + аммиак

1%-ный водный раствор аммиака

60

140

43,4±3,4

4,4

1,9

*Относительно сухого корня аралии; ** относительно традиционного метода экстракции

Показано (Табл. 3), что экстракция субкритической водой с добавлением следов аммиака в статическом режиме позволяет извлечь в 1.9 раза больше аралозидов А, В и С, чем традиционно используемый метод экстракции метанолом. Этот результат можно объяснить тем, что в субкритических условиях происходит как более эффективное проникновение растворителя вглубь мицеллы, так и частичное разрушение клеток растения, способствующее извлечению аралозидов. Добавление небольшого количества аммиака позволило перевести смесь различных солей аралозидов в водорастворимую аммонийную соль. При этом следует отметить, что и чистая вода без примеси аммиака в субкритических условиях позволяет извлечь большее количество аралозидов по сравнению с традиционным методом. Кроме преимуществ в доле извлечения, в субкритических условиях процесс экстракции аралозидов идет в 3 раза быстрее, к тому же с использованием экологически безопасного растворителя–воды.

3. Изомеризация апорфинового алкалоида глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин в среде субкритической воды

Изучена изомеризация нерацемической смеси энантиомеров природного апорфинового алкалоида глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин в среде субкритической воды при температуре 200-300ºС в герметических условиях. В результате исследования был получен дес-глауцин (в англоязычной литературе seco-glaucine) с выходом 53%.



Страницы: 1 | 2 | Весь текст