Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и не

На правах рукописи

Дементьева Елена Вячеславовна

СТАТУС ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА НА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЕ У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК

Генетика – 03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск

2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор

Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

доктор биологических наук

Лебедев И.Н.

НИИ медицинской генетики СО РАМН,

г. Томск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена, г. Москва

Защита состоится «_28_»__апреля_____2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: HYPERLINK «mailto:[email protected]» [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «___»____________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дозовая компенсация генов половых хромосом является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной биологии. Необходимость дозовой компенсации возникает у организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по морфологии и генетическому содержанию. Специализация половых хромосом у самцов млекопитающих приводит к нарушению соотношения уровней экспрессии генов Х-хромосомы между полами, которое устраняется с помощью подавления транскрипции, инактивации, генов на одной из двух Х-хромосом у самок. Процесс инактивации Х-хромосомы изучается уже на протяжении нескольких десятилетий. И хотя в понимании его механизмов достигнут значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.

Гены Х-хромосомы самок млекопитающих в различной степени вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о статусе экспрессии генов Х-хромосомы у человека, мыши и некоторых других видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et al., 2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для Х-хромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов Х-хромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают инактивации, на сегодняшний день не известны.

Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы: импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist. Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist РНК вдоль инактивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций транскрипционно неактивного хроматина (Heard, Disteche, 2006; Шевченко и др., 2006). Было показано, что при случайной инактивации в соматических тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными типами G-бэндов и отличаются по времени репликации в поздней S-фазе (Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). Тем не менее, остается неясным, свойственна ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два типа гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы при импринтированной инактивации.

Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений. Принято считать, что за стабильность случайной инактивации у человека и мыши отвечает метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы. Роль метилирования ДНК в процессе импринтированной инактивации еще только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.

Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus. В данной работе на примере обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной инактивации.

Цель и задачи работы. Цель работы – установление статуса экспрессии генов и модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;

Сравнение статуса метилирования промоторных областей и/или первых экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;

Выяснение характера распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в фибробластах, трофобластных стволовых клетках и клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок.

Научная новизна работы. На основе клеточных линий самок межвидовых гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis создана модельная система для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии 15 генов в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. Проведено сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследован характер распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах при импринтированной инактивации Х-хромосомы.

Положения, выносимые на защиту.

В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация Х-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с соматическими тканями;

В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от экстраэмбриональных тканей наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Х-хромосомы и их транскрипционной активностью;

При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух типов гетерохроматина, различающихся по составу и локализации.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 – 22 сентября 2006 г.), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа – 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликованы три работы. Одна – в рецензируемом отечественном журнале, две – в рецензируемых зарубежных журналах.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК выполнялась совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом клеточных линий обыкновенных полевок проводился совместно с к.б.н. С.В. Павловой и к.б.н. А.И. Шевченко.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы (182 наименования). Работа изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ

1. Получение и цитогенетическая характеристика линий фибробластов самок гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis.

Первичные культуры фибробластов легкого гибридной самки M. rossiaemeridionalis × M. arvalis получали методом трипсинизации (Nesterova et al., 1994). Препараты метафазных хромосом субклонов готовили согласно (Nesterova et al., 1998). Для выявления позднореплицирующегося хроматина за 6 часов до начала приготовления цитогенетических препаратов метафазных хромосом к клеткам добавляли 5-бромдезоксиуридин. Дальнейшую обработку препаратов и иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к 5-бромдезоксиуридину проводили как описано в работе Shevchenko et al. (2009). РНК-ДНК FISH с зондами на Xist РНК и повтор MS4 из блока гетерохроматина Х-хромосомы M. rossiaemeridionalis был выполнен по стандартным методикам (Lawrence et al. 1989; Fantes et al., 1995). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON X100 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar.

2. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

РНК была выделена из 12,5-дневных эмбрионов самцов и самок M. arvalis и M. rossiaemeridionalis, а также из фибробластов легкого, плацент и субклона линии клеток экстраэмбриональной эндодермы (XEN) гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis с помощью TRI REAGENT (Sigma) или RNAzol B (Biogenesis) согласно инструкциям фирм производителей. Для очистки образцов РНК от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и random decamer праймеров (Invitrogene) согласно прилагаемым рекомендациям. При анализе экспрессии гена Xist в экстраэмбриональных тканях для синтеза кДНК использовался цепь-специфичный праймер SDX3 (5’-cccagtgctggtgagctattcc-3’). Полученная кДНК амплифицировалась с помощью ПЦР. Нуклеотидную последовательность ПЦР-продуктов определяли согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation) на автоматическом секвенаторе в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Поиск межвидовых отличий нуклеотидных последовательностей кДНК осуществлялся программой SeqMan (DNASTAR). Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах, плацентах и клетках XEN самок гибридов M. rossiaemeridionalis × M. arvalis определяли методом удлинения праймера на 1 нуклеотид (single nucleotide primer extension, SNuPE) (Singer-Sam et al., 1992). В случае генов Chm, Nap1l3, Rbbp7, Sybl1, Utx в реакции добавлялись [α32P]dATP или [α32P]dGTP; для генов Atrx, Ddx3x, Hprt, Mid1, Pgk1, Rab9, Sb1.8, Slc7a3, Ube1x, Xist использовались [α32P]dCTP или [α32P]dTTP.

3. Определение статуса метилирования генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

Геномная ДНК из печени, трофобластных стволовых (ТС) и XEN клеток была выделена как описано в работе Слободянюка с соавт. (1994). Геномная ДНК гидролизировалась EcoRI, а затем чувствительными к метилированию эндонуклеазами рестрикции (New England BioLabs). Саузерн блот-гибридизацию с зондами на промоторную область и/или первый экзон генов проводили согласно руководству Маниатис и др. (1984). Подбор чувствительных к метилированию эндонуклеаз рестрикции осуществляли с помощью программы MapDraw (DNASTAR).

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом.

Цитоцентрифугирование фибробластов, ТС и XEN клеток и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом антителами к различным модификациям хроматина проводилось как описано в работе Shevchenko et al. (2009). Анализ препаратов осуществлялся как при ДНК-РНК FISH. Для каждой модификации хроматина было проанализировано не менее 100 метафазных пластинок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических тканях обыкновенных полевок из легкого гибридной самки M. rossiaemeridionalis × M. arvalis была получена первичная культура фибробластов. У гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis инактивация Х-хромосомы происходит неслучайным образом. В 85% клеток неактивной становится Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, остальные клетки содержат неактивную Х-хромосому M. arvalis (Zakian et al., 1987). Чтобы иметь линии фибробластов, где точно известно, Х-хромосома какого вида неактивна, было проведено субклонирование первичной культуры. В результате были получены четыре субклона фибробластов (линии SA004, SA005, SA006, SA007). В работе также использовался ранее полученный в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН субклон фибробластов гибридной самки M. rossiaemeridionalis × M. arvalis (линия SAD4). Транскрипционный статус Х-хромосом обоих видов в субклонах оценивался на основании двух свойств неактивной Х-хромосомы: более поздней репликации по сравнению с активным гомологом и экспрессии гена Xist. Было показано, что в субклонах SA004-7 неактивной является Х-хромосома M. rossiaemeridionalis, а в субклоне SAD4 – Х-хромосома M. arvalis. В качестве экстраэмбриональных тканей использовались плаценты и субклон клеток XEN гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis, в которых импринтированной инактивации подвергается отцовская Х-хромосома M. arvalis (Шевченко и др., 2008).

Для того чтобы различить аллели генов на активной и неактивной Х-хромосоме в клетках гибридных самок, был осуществлен поиск межвидовых различий нуклеотидных последовательностей их кДНК у M. arvalis и M. rossiaemeridionalis. Пары праймеров были подобраны по известным нуклеотидным последовательностям генов обыкновенных полевок или нуклеотидным последовательностям ортологичных генов мыши, крысы и человека. ПЦР-продукты ожидаемых размеров с кДНК M. arvalis и M. rossiaemeridionalis были получены для 26 генов. Секвенирование подтвердило их гомологию исследуемым генам. Межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК были найдены только для 15 генов. В случае остальных 11 генов межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК не были обнаружены, что в дальнейшем не позволило определить их статус экспрессии.

При исследовании статуса экспрессии 15 генов в фибробластах обыкновенных полевок были обнаружены практически все типы экспрессии генов Х-хромосомы (рис. 1). Так, гены Atrx, Chm, Hprt, Mid1, Nap1l3, Pgk1, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybl1, Ube1x экспрессируются на активной Х-хромосоме и подвергаются инактивации на неактивной Х-хромосоме. Ген Xist экспрессируется на неактивной Х-хромосоме, а на активной Х-хромосоме его транскрипция репрессирована. Ген Utx экспрессируется как на активной, так и на неактивной Х-хромосоме, т.е. избегает инактивации. Статус экспрессии этих 13 генов одинаков во всех 5 исследуемых субклонах фибробластов в отличие от генов Sb1.8 и Ddx3x. В линиях SA004-7 ген Sb1.8 экспрессируется на активной Х-хромосоме, а в линии SAD4 – на активной и неактивной Х-хромосоме. Напротив, ген Ddx3x экспрессируется на обеих Х-хромосомах в линиях SA004-7 и лишь на активной Х-хромосоме в линии SAD4. По-видимому, гены Sb1.8 и Ddx3x имеют гетерогенную экспрессию у обыкновенных полевок. Поскольку субклоны SA004-7 и SAD4 были получены из первичных культур фибробластов легкого разных гибридных самок, то уровень экспрессии генов Sb1.8 и Ddx3x может варьировать между особями и, если эта разница в уровне экспрессии имеет какое-либо значение, то она может вносить вклад в индивидуальные различия.

По профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок более сходна с Х-хромосомой мыши, чем с Х-хромосомой человека. Так, на Х-хромосоме обыкновенных полевок была выявлена группа инактивирующихся генов Chm, Nap1l3, Rab9, Rbbp7, Ube1x. У человека ортологи большинства из них избегают инактивации (Carrel, Willard, 1999, 2005). У мыши установлен статус экспрессии лишь для гена Ube1x, который также подвергается инактивации (Carrel et al., 1996; Yen et al., 2007). Кроме того, известно, что ряд генов, избегающих инактивации у человека, подвергается инактивации у мыши (Disteche, 1995, 1999; Brown, Greally, 2003). Возможно, что у представителей отряда грызунов (мышь, обыкновенные полевки и др.) число избегающих инактивации генов может быть меньше, чем в других отрядах плацентарных, либо инактивации избегают совсем другие гены Х-хромосомы. Это предполагает, что эволюция процесса инактивации Х-хромосомы в различных группах плацентарных млекопитающих происходила независимым образом.

Ранее было показано, что некоторые гены и трансгены, подвергающиеся инактивации в соматических тканях, способны экспрессироваться на неактивной Х-хромосоме в экстраэмбриональных тканях (Kratzer et al., 1983; Krumlauf et al., 1986; Hadjantonakis et al., 2001; Garrick et al., 2006). В связи с этим принято считать, что импринтированная инактивация Х-хромосомы является менее полной и/или стабильной, чем случайная. Тем не менее, систематического исследования статуса экспрессии генов Х-хромосомы при импринтированной инактивации до сих пор не проводилось.

Рис. 1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах и экстраэмбриональных тканях гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis. Xa и Xi – активная и неактивная Х-хромосомы, arv – M. arvalis, ros – M. rossiaemeridionalis, XEN – клетки экстраэмбриональной эндодермы. Контрольные реакции проводились без добавления матрицы.

В плацентах и субклоне клеток XEN обыкновенных полевок большинство исследуемых генов имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах (рис. 1). Гены Hprt, Nap1l3, Pgk1, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybl1 экспрессируются только на активной Х-хромосоме. Экспрессия гена Xist осуществляется лишь с неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации. Однако между профилями экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок был обнаружен ряд отличий. Гены Sb1.8 и Ddx3x, которые имеют гетерогенную экспрессию в фибробластах, экспрессируются на активной и неактивной Х-хромосоме в обоих типах экстраэмбриональных тканей. Инактивирующийся в фибробластах ген Ube1x экспрессируется на обеих Х-хромосомах в субклоне клеток XEN и в плаценте. Интересно, что гены Atrx, Chm, Mid1 демонстрируют линиеспецифическую инактивацию. В плаценте гены Atrx и Mid1 экспрессируются на обеих Х-хромосомах, а в субклоне клеток XEN инактивируются также как и в фибробластах. Напротив, ген Chm подвергается инактивации в плаценте и фибробластах, но экспрессируется на обеих Х-хромосомах в субклоне клеток XEN. Линиеспецифичность инактивации генов Atrx, Chm и Mid1 может быть следствием относительной нестабильности импринтированной инактивации. Кроме того, линиеспецифичность инактивации (доза) некоторых генов Х-хромосомы может влиять на развитие и функционирование экстраэмбриональных тканей. Это предположение подкрепляется тем, что ген Atrx избегает инактивации в производных трофобласта и подвергается инактивации в экстраэмбриональной эндодерме не только у обыкновенных полевок, но и у мыши (Garrick et al., 2006; Patrat et al., 2009).

Таким образом, часть генов, подвергающихся инактивации в соматических тканях, может экспрессироваться на неактивной Х-хромосоме в экстраэмбриональных тканях. Это свидетельствует в пользу предположений о меньшей полноте и/или стабильности импринтированной инактивации. Вероятно, соматические и экстраэмбриональные ткани имеют различные потребности в дозовой компенсации генов Х-хромосомы. Поскольку экстраэмбриональные ткани необходимы в онтогенезе млекопитающих ограниченный период времени, дозовая компенсация при импринтированной инактивации Х-хромосомы может быть менее строгой (Heard, 2005), и значение имеет только уровень экспрессии ограниченного набора генов Х-хромосомы.

2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Статус метилирования определялся для 4 генов Х-хромосомы с известными нуклеотидными последовательностями промоторной области и/или 1 экзона (рис. 2). Были использованы печени самцов и самок M. arvalis и M. rossiaemeridionalis, а также недифференцированные и дифференцированные ТС и XEN клетки M. rossiaemeridionalis. В ТС клетках обыкновенных полевок, как и в XEN клетках, инактивация Х-хромосомы импринтирована (Grigor’eva et al., 2009).

Рис. 2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. ТС – трофобластные стволовые клетки самок M. rossiaemeridionalis: н – недифференцированные, д – дифференцированные. XEN – клетки экстраэмбриональной эндодермы M. rossiaemeridionalis.

Рис. 3. Модификации хроматина в фибробластах самок M. rossiaemeridionalis. А. Триметилированный Н3К27 (3meH3K27) и убиквитинированный гистон Н2А (uH2A). Б. Триметилированный Н3К9 (3meH3K9) и триметилированный Н3К27 (3meH3K27). В. Гетерохроматиновый белок НР1 и триметилированный Н3К27 (3meH3K27). Xa и Xi – активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался 4,6–диамидино-2-фенилиндол (DAPI).

Рис. 4. Модификации хроматина в клетках экстраэмбриональной эндодермы самок M. rossiaemeridionalis. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом антителами к гетерохроматиновому белку НР1 и убиквитинированному гистону Н2А (uH2A). Xa и Xi – активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался DAPI.

Рис. 5. Модификации хроматина в недифференцированных трофобластных стволовых клетках самок M. rossiaemeridionalis. А. Убиквитинированный гистон Н2А (uH2A) и триметилированный Н3К9 (3meH3K9). Б. Гетерохроматиновый белок НР1 и триметилированный Н3К9 (3meH3K9). В. Убиквитинированный гистон Н2А (uH2A) и триметилированный Н3К27 (3meH3K27). Xa и Xi – активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался DAPI.

Рис. 6. Модификации хроматина в трофобластных стволовых клетках самок M. rossiaemeridionalis на различных стадиях дифференцировки. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер антителами к гетерохроматиновому белку НР1 и триметилированному Н3К27 (3meH3K27). Верхний ряд соответствует 4 дню дифференцировки, нижний ряд – 6 дню дифференцировки.

В соматических тканях самцов обыкновенных полевок были выявлены только неметилированные аллели генов Nap1l3 и Sb1.8. У самок наблюдаются неметилированные и метилированные аллели, которые, по всей видимости, соответствуют активной и неактивной Х-хромосоме. Это результат согласуется с инактивацией гена Nap1l3 и гетерогенной экспрессией гена Sb1.8 в фибробластах полевок. Ген Xist полностью метилирован у самцов и частично метилирован у самок, что соответствует его репрессии у самцов и экспрессии лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. Ген Utx не подвергается метилированию ни у самцов, ни у самок обыкновенных полевок, что согласуется с его экспрессией на единственной Х-хромосоме у самцов и обеих Х-хромосомах у самок.

Метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы является самым поздним событием при установлении случайной инактивации и считается ответственным за стабильное поддержание неактивного состояния (Brockdorff, 2002). У человека и мыши между статусом метилирования CpG-островков 5’ областей и транскрипционной активностью генов Х-хромосомы прослеживается четкая корреляция: активные аллели не метилированы, тогда как неактивные аллели метилированы (Carrel et al., 1996; Gilbert, Sharp, 1999; Matarazzo et al., 2002). Данная закономерность наблюдается и в соматических тканях обыкновенных полевок и означает, что метилирование ДНК в промоторных районах и/или 1 экзонах генов Х-хромосомы играет важную роль в поддержании их неактивного состояния при случайной инактивации.

В экстраэмбриональных тканях статус метилирования генов неактивной Х-хромосомы до сих пор остается неясным. Считается, что уровень метилирования генов неактивной Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях ниже, чем в соматических тканях. Об этом свидетельствуют экспрессия некоторых генов и трансгенов на неактивной Х-хромосоме (Kratzer et al., 1983; Krumlauf et al., 1986; Hadjantonakis et al., 2001; Garrick et al., 2006), а также устойчивость экстраэмбриональных тканей к экстенсивному деметилированию in vivo (Sado et al., 2000). Однако CpG-динуклеотиды в 5’ областях некоторых генов Х-хромосомы подвергаются метилированию в экстраэмбриональных тканях мыши и человека (Grant et al., 1992; Norris et al., 1994; Goto et al., 1997).

У обыкновенных полевок в клетках XEN, как и в фибробластах, ген Nap1l3 не подвергается метилированию у самца и частично метилируется у самки, что согласуется с его инактивацией в данной линии клеток (рис. 2). Несмотря на то, что в плаценте ген Nap1l3 также инактивируется, он не метилируется в ТС клетках самки ни до дифференцировки, ни в процессе дифференцировки. Это означает, что метилирование данного гена на неактивной Х-хромосоме может осуществляться на более поздних стадиях дифференцировки либо он остается гипометилированным в производных трофобласта. Ген Sb1.8 избегает инактивации и в плаценте, и в клетках XEN. Однако в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок выявляется метилированный аллель гена Sb1.8. Известно, что уровень экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, как правило, ниже, чем на активной Х-хромосоме (Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Johnston et al., 2008). В таком случае метилирование гена Sb1.8 в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок могло бы отражать более низкий уровень экспрессии его аллеля на неактивной Х-хромосоме. Возможно также, что в ТС и XEN клетках метилирование ДНК не принимает участия в регуляции экспрессии генов Nap1l3 и Sb1.8 или метилирование совсем других CpG-сайтов участвует в регуляции их экспрессии. Об этом может свидетельствовать метилирование единственного аллеля гена Sb1.8 в XEN клетках самца. Статусы экспрессии и метилирования генов Xist и Utx сходны в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. В экстраэмбриональных тканях ген Xist также репрессирован у самцов и транскрибируется лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. В клетках XEN самцов ген Xist полностью метилирован. В ТС и XEN клетках самок наряду с метилированным аллелем выявляется неметилированный аллель, соответствующий экспрессии данного гена на неактивной Х-хромосоме. Ген Utx не метилируется ни в ТС клетках, ни в клетках XEN у обыкновенных полевок, что согласуется с избеганием инактивации в плаценте и клетках XEN.

В экстраэмбриональных тканях метилирование ДНК, вероятно, участвует в регуляции экспрессии только части генов Х-хромосомы. Значит, при импринтированной инактивации Х-хромосомы метилирование ДНК может оказаться менее важным для поддержания неактивного состояния, чем при случайной, и другие эпигенетические механизмы, например, Polycomb белки (Wang et al., 2001; Plath et al., 2004), могут вносить основной вклад в инактивацию генов в экстраэмбриональных тканях. Меньшей роли метилирования ДНК в поддержании неактивного состояния генов при импринтированной инактивации может способствовать ограниченная по времени необходимость в экстраэмбриональных тканях, и в результате корректно метилированными оказываются только те гены Х-хромосомы, уровень экспрессии которых является критичным.

3. Модификации хроматина Х-хромосомы обыкновенных полевок при случайной и импринтированной инактивации.

Модификации хроматина исследовались у самок M. rossiaemeridionalis на примере фибробластов, где инактивация Х-хромосомы происходит случайным образом, а также XEN и ТС клеток, где инактивация импринтирована (Шевченко и др., 2008; Grigor’eva et al., 2009). Клетки XEN получают из гипобласта бластоцисты, поэтому они могут моделировать события, происходящие в экстраэмбриональной эндодерме. ТС клетки, по-видимому, отражают события, происходящие в трофобластной линии экстраэмбриональных тканей.

Методом иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом антителами к различным модификациям хроматина на неактивной Х-хромосоме фибробластов и большинства клеток XEN были обнаружены два неперекрывающихся типа гетерохроматина. Первый тип гетерохроматина представлен триметилированным по лизину в 27 положении гистоном Н3 (3meН3К27) и моноубиквитинированным по лизину в 119 положении гистоном Н2А (uH2A) (рис. 3А, 4). Их локализация совпадает с G-негативными бэндами Х-хромосомы, а также с ранее установленной локализацией Xist РНК (Duthie et al., 1999). Второй тип гетерохроматина образован триметилированным по лизину в 9 положении гистоном Н3 (3meН3К9) и гетерохроматиновым белком HP1 и соответствует G-позитивным бэндам Х-хромосомы (рис. 3Б-В, 4). Кроме того, 3meН3К9 и НР1 выявляются в центромерных и теломерных районах аутосом и половых хромосом, а также в блоках конститутивного гетерохроматина на обеих, активной и неактивной, Х-хромосомах.

На примере хромосом человека и мыши было показано, что 3meH3K27 локализуется в участках хроматина, содержащих неактивные гены, фланкирующие межгенные районы и SINE элементы. Напротив, 3meH3K9 маркирует протяженные участки неактивного хроматина, обогащенные LINE элементами и LTR и имеющие низкую плотность генов (Valley et al., 2006; Chadwick, 2007; Pauler et al., 2009). Таким образом, на неактивной Х-хромосоме, по всей видимости, действуют две системы сайленсинга, направленные на инактивацию различных типов нуклеотидных последовательностей. Гетерохроматин первого типа (3meН3К27, uH2A и Xist РНК) необходим для инактивации генов, в то время как гетерохроматин второго типа (3meН3К9 и НР1) участвует в инактивации районов Х-хромосомы, содержащих преимущественно повторенные последовательности.

До настоящего времени существование на неактивной Х-хромосоме двух различных по набору модификаций и локализации типов гетерохроматина было установлено лишь для человека (приматы) и коровы (парнокопытные) (Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). В данной работе они выявлены на неактивной Х-хромосоме в фибробластах и клетках XEN самок обыкновенных полевок – представителей еще одного отряда плацентарных млекопитающих, грызунов. Этот факт свидетельствует, во-первых, о едином принципе поддержания неактивного состояния при случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а, во-вторых, о сходстве структуры хроматина неактивной Х-хромосомы у различных видов плацентарных.

В недифференцированных ТС клетках самок M. rossiaemeridionalis, которые, вероятно, представляют ранние этапы импринтированной инактивации, характер распределения 3meН3К9, НР1 и uH2A существенно отличается от фибробластов и клеток XEN. 3meН3К9, НР1 и, что удивительно uH2A, были равномерно распределены вдоль всей неактивной Х-хромосомы и детектировались в центромерных и теломерных районах на аутосомах и обеих Х-хромосомах (рис. 5А, Б). Интересно, что примерно в половине случаев uH2A не обнаруживался в блоке конститутивного гетерохроматина неактивной Х-хромосомы (рис. 5В), а 3meН3К9 и НР1 не выявлялись в блоке конститутивного гетерохроматина на активной Х-хромосоме (рис. 5А, Б). Это свидетельствует о том, что на данных стадиях развития блок конститутивного гетерохроматина на Х-хромосоме еще окончательно не сформирован.

На неактивной Х-хромосоме в недифференцированных ТС клетках не был выявлен 3meН3К27 (рис. 5В). Интересно, что в ТС клетках мыши 3meН3К27 является типичной для неактивной Х-хромосомы модификацией хроматина (Mak et al., 2002; Silva et al., 2003). Данное различие может объясняться иной динамикой процесса инактивации в предымплантационном развитии по сравнению с мышью. Считается, что 3meН3К27 отвечает за появление на неактивной Х-хромосоме uH2A (de Napoles et al., 2004; Plath et al., 2004). Однако в недифференцированных ТС клетках полевок uH2A появляется на неактивной Х-хромосоме раньше, чем 3meН3К27, что подтверждает существование независимого от 3meН3К27 механизма убиквитинирования гистона Н2А (Schoeftner et al., 2006).

Структура хроматина неактивной Х-хромосомы в недифференцированных ТС клетках обыкновенных полевок очень сходна со структурой Х-хромосомы в сперматогенезе млекопитающих. Те же самые модификации хроматина (3meН3К9, НР1, uH2A) устанавливаются на Х-хромосоме в пахитене первого деления мейоза, когда инициируется мейотическая инактивация половых хромосом, и сохраняются после мейоза вплоть до замены гистонов на протамины. Этот факт указывает на возможность существования связи между мейотической и импринтированной инактивацией Х-хромосомы и предполагает, что модификации хроматина, установленные в процессе мейотической инактивации, могут быть тем самым импринтом, который обеспечивает инактивацию отцовской Х-хромосомы в раннем развитии.

Для того чтобы выяснить, когда 3meН3К27 появляется на неактивной Х-хромосоме, были исследованы ТС клетки на различных стадиях дифференцировки (рис. 6). На 4 день дифференцировки 3meН3К27 обнаруживается на неактивной Х-хромосоме лишь в отдельных клетках. На 6 день дифференцировки 3meН3К27 наблюдается практически во всех ТС клетках. Установление 3meН3К27 сопровождается снижением уровня 3meН3К9 и НР1 на неактивной Х-хромосоме. Вероятно, в процессе дифференцировки ТС клеток происходит постепенное замещение системы сайленсинга 3meН3К9/НР1 на 3meН3К27/uH2A, а дальнейшее поддержание неактивного состояния Х-хромосомы в трофобластной линии осуществляется, как в экстраэмбриональной эндодерме и при случайной инактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа направлена на изучение механизмов инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Впервые установлены статусы экспрессии и метилирования генов, а также распределение модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

В соматических тканях, фибробластах гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis, были обнаружены практически все известные на сегодняшний день типы экспрессии генов Х-хромосомы: инактивирующиеся, избегающие инактивации, гены с гетерогенной экспрессией. Сравнение полученных результатов с данными, имеющимися по человеку и мыши, показало, что по профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок сходна с мышиной Х-хромосомой и, скорее всего, заметно отличается по набору избегающих инактивации генов от Х-хромосомы человека.

Исследование статуса экспрессии генов Х-хромосомы в плацентах и субклоне клеток XEN гибридных самок дало возможность сравнить профили экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок большинство исследуемых генов Х-хромосомы имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах. Однако несколько генов Х-хромосомы, которые подвергались инактивации в фибробластах, экспрессировались на обеих Х-хромосомах, по крайней мере, в одном из типов экстраэмбриональных тканей. Этот факт подтвердил высказанные ранее предположения о меньшей полноте и/или стабильности импринтированной инактивации Х-хромосомы по сравнению со случайной.

Определение статуса метилирования промоторных областей и/или 1 экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок позволило выяснить роль метилирования ДНК в процессах случайной и импринтированной инактивации. В соматических тканях наблюдалось четкое соответствие между статусами экспрессии и метилирования гена: транскрипционно активные аллели не подвергались метилированию, тогда как транскрипционно неактивные аллели были метилированы. Этот результат согласуется с данными, имеющимися по мыши и человеку, и свидетельствует о важности метилирования ДНК для поддержания неактивного состояния генов при случайной инактивации Х-хромосомы. В экстраэмбриональных тканях данная закономерность соблюдалась лишь для части генов, т.е. при импринтированной инактивации ведущая роль в поддержании неактивного состояния генов, вероятно, принадлежит другим модификациям хроматина.

Изучение распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах фибробластов, а также XEN и ТС клеток самок M. rossiaemeridionalis, дало возможность сравнить структуру хроматина неактивной Х-хромосомы при случайной и импринтированной инактивации. Было показано, что при случайной и импринтированной инактивации на неактивной Х-хромосоме устанавливаются два неперекрывающихся типа гетерохроматина: один образован 3meН3К27 и uH2A, другой – 3meН3К9 и HP1. Поскольку те же самые типы гетерохроматина были ранее обнаружены у человека и коровы, то они, по-видимому, являются универсальными для неактивной Х-хромосомы плацентарных млекопитающих.

В недифференцированных ТС клетках, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, 3meН3К27 не выявляется, а 3meН3К9, HP1 и uH2A равномерно распределены вдоль неактивной Х-хромосомы. Аналогичную структуру хроматина имеет Х-хромосома в сперматогенезе млекопитающих, что предполагает существование связи между мейотической и импринтированной инактивацией. 3meН3К27 устанавливается на неактивной Х-хромосоме в процессе дифференцировки ТС клеток, что сопровождается снижением уровня 3meН3К9 и HP1.

Полученные данные способствуют пониманию эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

ВЫВОДЫ

В фибробластах гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis выявлены все основные типы экспрессии генов Х-хромосомы. 11 генов (Atrx, Chm, Hprt, Mid1, Nap1l3, Pgk1, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybl1, Ube1x) подвергаются инактивации, ген Xist транскрибируется только с неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации, гены Sb1.8 и Ddx3x демонстрируют гетерогенную экспрессию;

В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация Х-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с фибробластами. Гены Atrx, Chm, Mid1, Ube1x, подвергающиеся инактивации в фибробластах, в плацентах и клетках экстраэмбриональной эндодермы гибридных самок M. rossiaemeridionalis × M. arvalis экспрессируются не только на активной, но и на неактивной Х-хромосоме;

В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Х-хромосомы и их транскрипционной активностью. Данный факт предполагает, что при случайной инактивации метилирование ДНК имеет большее значение для поддержания неактивного состояния генов Х-хромосомы, чем при импринтированной инактивации;

При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух неперекрывающихся типов гетерохроматина: первый образован триметилированным H3K27 и убиквитинированным H2A, второй – триметилированным H3K9 и гетерохроматиновым белком HP1;

В недифференцированных трофобластных стволовых клетках обыкновенных полевок, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, триметилированный Н3К9, НР1 и убиквитинированный Н2А равномерно распределены на неактивной Х-хромосоме, а триметилированный Н3К27 отсутствует. Триметилирование Н3К27 на неактивной Х-хромосоме происходит в процессе дифференцировки трофобластных стволовых клеток и сопровождается снижением уровня триметилированного H3K9 и HP1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В., Голубева Д.В., Закиян С.М. Модификации хроматина в процессе инактивации X-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.

Dementyeva E.V., Shevchenko A.I., Zakian S.M. X-chromosome upregulation and inactivation two sides of the dosage compensation mechanism in mammals // BioEssays. 2009. V. 31. № 1. P. 21-28.

Shevchenko A.I., Pavlova S.V., Dementyeva E.V., Zakian S.M. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis // Mammalian Genome. 2009. V. 20. № 9-10. P. 644-653.

Dementyeva E.V., Shevchenko A.I., Anopriyenko O.V., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. X-linked genes mapping and expression status analysis in common voles // Book of abstracts of the 2nd Conference on X-inactivation. Paris, 2006. P. 68.

Дементьева Е.В., Шевченко А.И., Аноприенко О.В., Мазурок Н.А., Закиян С.М. Картирование и статус экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 2007. С. 65-66.

Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 2007. С. 186.

Васькова Е.А., Дементьева Е.В. Сравнение модификаций хроматина неактивной Х-хромосомы фибробластов и трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок // Материалы XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция биология. Новосибирск, 2008. С. 100-101.

Вагнер Т.В., Дементьева Е.В. Изучение статуса экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus // Тез. докл. Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция биология. Москва, 2009. С. 88.

Дементьева Е.В., Шевченко А.И., Вагнер Т.В., Закиян С.М. Статусы экспрессии и метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок // Материалы Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С. 94-95.

Васькова Е.А., Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В., Григорьева Е.В., Закиян С.М. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы у обыкновенных полевок // Материалы Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С. 94.

PAGE

PAGE 3