Стандартизация сырья, настоек гомеопатических матричных и фермен

На правах рукописи

Волжанова Марина Игоревна

СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ, НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ И ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ КАЛАНХОЭ И ХВОЩА

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2010 г.

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»(ГОУ ВПО РУДН) на кафедре общей фармацевтической и биомедицинской технологии (заведующий кафедрой академик РАМН и РАСХН В.А.Быков).

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук,

доцент

Светлана Николаевна Суслина

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор

Зинаида Петровна Костенникова

Кандидат фармацевтических наук

Янина Федоровна Копытько

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Защита диссертации состоится «___» ____________ 2010 г.в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва,ул. Красина, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан: «___»_________ 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

А.И.Громакова

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной фармацевтической науки является создание отечественной Гомеопатической фармакопеи. В Российской Федерации отмечается значительное развитие гомеопатического производства, а также увеличение объемов регистрации новых гомеопатических препаратов и реализации их на фармацевтическом рынке, что диктует необходимость разработки и внедрения унифицированных стандартов качества на них. Необходимость создания Гомеопатической фармакопеи продиктована, в частности, отставанием нормативной базы от темпов производства гомеопатии в нашей стране.

В настоящее время действуют общие фармакопейные статьи (ОФС)||«Настойки гомеопатические матричные», «Настойки гомеопатические матричные ферментированные» и фармакопейные статьи (ФС) на настойки гомеопатические матричные (НГМ), но отсутствуют ФС на настойки гомеопатические матричные ферментированные (НГМФ), которые применяют для изготовления ряда гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС). Качество ГомЛС обеспечивается строгим соблюдением технологии изготовления и использованием стандартизованных субстанций, в связи с этим остается актуальным совершенствование методов контроля качества и стандартизации НГМ и НГМФ.

В частности, своевременным является создание ФС на НГМ и НГМФ каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, а также хвоща полевого.В отечественной медицине достаточно широко применяют ЛС на основе лекарственного растительного сырья каланхоэ перистого и хвоща полевого, вместе с тем каланхоэ Дегремона практически не представлено. Разработанные методики качественного и количественного определения основной группы биологически активных веществ сырья с помощью современных химических и физико-химических методов являются отправной точкой в разработке методик сквозной стандартизации НГМ каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, а также НГМ и НГМФ хвоща полевого и лекарственных форм на основе НГМ и НГМФ.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование по стандартизации сырья каланхоэ Дегремона и перистого, настоек гомеопатических матричных и ферментированных на его основе, а также настоек гомеопатических матричных и ферментированных хвоща полевого.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Провести сравнительный фармакогностический анализ свежесобранного сырья каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого;

Провести сравнительные исследования фенольных соединений НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого и разработать методики их стандартизации;

Провести исследования фенольных соединений и разработать методики стандартизации НГМ и НГМФ хвоща полевого;

Разработать методики установления подлинности гомеопатических разведений НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, а также НГМ и НГМФ хвоща полевого;

Разработать методики стандартизации для проектов ФС «Побеги каланхоэ свежие», «Настойка гомеопатическая матричная каланхоэ – Tinctura materna homoeopathica Kalanchoe», «Настойка гомеопатическая матричная ферментированная каланхоэ – Tinctura materna homoeopathica Kalanchoe ferm 1.2», «Настойка гомеопатическая матричная хвоща полевого – Tinctura materna homoeopathica Equisetum arvense», «Настойка гомеопатическая матричная ферментированная хвоща полевого – Tinctura materna homoeopathica Equisetum arvense ferm 2.2»;

Разработать проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Каланхоэ ферм суппозитории ректальные гомеопатические».

Научная новизна. На основании макро- и микроскопического анализа впервые установлены диагностически значимые признаки в морфологическом и анатомическом строении сырья каланхоэ Дегремона, а также впервые изучены в сравнительном аспекте морфолого-анатомические признаки двух видов рода Каланхоэ – каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого.

На основании проведенного сравнительного фармакогностического анализа свежесобранных побегов каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого, а также опыта применения в гомеопатии ГомЛС на основе данных видов сырья установлена возможность их совместного применения.

Впервые изучен качественный и количественный состав фенольных соединений в НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, а также НГМ и НГМФ хвоща полевого. Применение современных физико-химических методов, в частности, хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спектрофотометрии в УФ- и видимой области спектра, позволило разработать методики стандартизации НГМ и НГМФ, которые являются промежуточным звеном сквозной стандартизации.

Показана возможность разработки лекарственной формы на основе НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:

Проект ФС «Побеги каланхоэ свежие»;

Проект ФС «Настойка гомеопатическая матричная каланхоэ – Tinctura materna homoeopathica Kalanchoe»;

Проект ФС «Настойка гомеопатическая матричная ферментированная каланхоэ – Tinctura materna homoeopathica Kalanchoe ferm 1.2»;

Проект ФС «Настойка гомеопатическая матричная хвоща полевого – Tinctura materna homoeopathica Equisetum arvense»;

Проект ФС «Настойка гомеопатическая матричная ферментированная хвоща полевого – Tinctura materna homoeopathica Equisetum arvense ferm 2.2»;

Проект ФСП «Каланхоэ ферм суппозитории ректальные гомеопатические».

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертация выполнялась в Российском университете дружбы народов на кафедре общей фармацевтической и биомедицинской технологии № темы 030601-2-073 по Государственному Контракту ГК П555/05.08.2009 – НК-97П, Проект: «Биоинженерия как основа мобилизации адаптивного потенциала биообъектов – суперпродуцентов БАВ». В соответствии с Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 — 2013 гг., в рамках реализации мероприятия №|1.2.1 «Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук».

Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований доложены на VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» в 2008|г., а также на Московских международных гомеопатических конференциях «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» в 2008 — 2010 гг.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 14 работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Результаты сравнительного фармакогностического исследования свежесобранного сырья каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого;

Результаты разработки методик качественного и количественного анализа фенольных соединений в сырье каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого,НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, обеспечивающих сквозную стандартизацию; результаты валидации методик анализа;

Результаты разработки методик качественного и количественного анализа действующих веществ в НГМ и НГМФ хвоща полевого; результаты валидации методик анализа;

Результаты разработки методики установления подлинности гомеопатических разведений НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, а также НГМ и НГМФ хвоща полевого;

Разработка проектов ФС на сырье каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого, НГМ каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, НГМ и НГМФ хвоща полевого, проекта ФСП на суппозитории ректальные гомеопатические Каланхоэ ферм.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 177 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 194 источника, в том числе 123 иностранных, 6 приложений. Работа содержит 53 рисунка и 79 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлена научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании обзора данных литературы представлено ботаническое описание, данные по химическому составу, применению в аллопатии и гомеопатии препаратов на основе сырья каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, а также хвоща полевого. Приведены описания стандартизации и контроля качества сырья, НГМ в зарубежных фармакопеях.

Во второй главе приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Третья глава посвящена фармакогностическому анализу сырья каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, установлению показателей, позволяющих идентифицировать сырье и контролировать его качество.

В четвертой главе представлен фитохимический анализ НГМ каланхоэ Дегремона, НГМ каланхоэ перистого, НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого, НГМ и НГМФ хвоща полевого с использованием современных физико-химических методов, результаты разработки показателей качества сырья, НГМ и НГМФ, а также методики анализа гомеопатических разведений НГМ и НГМФ.

Пятая глава содержит результаты разработки лекарственной формы на основе НГМФ каланхоэ Дегремона/перистого – суппозиториев ректальных гомеопатических Каланхоэ ферм.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Объекты исследования – свежесобранное сырье каланхоэ Дегремона (Kalanchoe daigremontiana Hamet et Perr.), каланхоэ перистого (Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers.), семейства толстянковые (Crassulaceae), заготовленное в 2007-2009 гг. в Отделе культурных растений Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина РАН, Москва; ЛРС хвоща полевого, заготовленное в2007-2009 гг. в Воскресенском районе Московской области. НГМ и НГМФ изготовлены на базе производственного отдела ООО|«Лекарственные средства ВАЛА-Р», Москва.

Для изучения анатомо-диагностических признаков в строении сырья каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого использовался микроскоп ЛОМО «МИКМЕД-1» с бинокуляром АУ-12 1,5× (окуляр 10× и объективы 3,7×, 8×, 20×, 40×). Микрофотографии выявленных диагностических признаков были выполнены с помощью цифровой фотокамеры Sony Cyber-schot и отредактированы в программе Adobe Photoshop CS Version 8.0.

Изучение архитектуры поверхности листьев двух растений проводилось на базе Центра коллективного пользования (научно-образовательного центра) РУДН с применением растрового электронного микроскопа марки JEOL JSM-6490, Япония, после нанесения 24 нм платины в автоматическом коутере JEOL auto fine coater JFC-1600.

Микроскопические исследования проводили согласно ОФС «Методы анализа лекарственного растительного сырья», раздел «Листья» и «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI, вып. 1, с. 252-256, с. 277-279.

Товароведческие показатели устанавливали в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1; ГФ XII, ч. 1; ГОСТ 24027.2-80 «Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла».

Для экстракции и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «Ч», «ХЧ», «ЧДА». Разделение веществ и их идентификацию осуществляли методом ТСХ на пластинах «Силикагель 60 F254 Merck». Были использованы стандартные образцы (СО) фенольных соединений, предоставленные отделом контроля качестваООО «Лекарственные средства ВАЛА-Р»: рутин (Carl Roth, 7178.1-100G), гиперозид (Carl Roth, 4215.1-25MG), галловая кислота (Sigma-Aldrich, G3784-100G), кофейная кислота (Carl Roth, 5869.1-10G), хлорогеновая кислота (Sigma-Aldrich, C3878-250MG), феруловая кислота (Sigma-Aldrich, 46278-1G-F), п-кумаровая кислота (Sigma-Aldrich, С9008-5G), кверцетин (Carl Roth, 7138.1-25G), кемпферол (Fluka, 60010), апигенин-7-гликозид (Sigma-Aldrich,44692-5MG-F).

Исследования по изучению состава фенольных соединений опытных образцов НГМ И НГМФ методом ВЭЖХ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе (насосы ВЭЖХ Beckman114M Solvent Delivery Module «A» и «В»; контроллер Beckman 421A; детектор с переменной длиной волны Spectroflow 757; миксер Beckman System Organizer, Германия; самописец Kipp and Zonen, Голландия) на базе Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Спектры поглощения в УФ- и видимой области спектра регистрировались с помощью спектрофотометра Cary WinUV фирмы Varian, США. Валидация аналитических методик проводилась в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».

Содержание сухого остатка, плотность, величину pH, испытания на микробиологическую чистоту НГМ и НГМФ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 2; ГФ XII, ч. 1.

Оценку качества изготовленных суппозиториев ректальных гомеопатических осуществляли согласно ГФ XI, вып. 2, с. 151 иОСТ 91500.05.001 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения».

2. Фармакогностический анализ сырья

каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого и хвоща полевого

Макроскопический анализ сырья каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого

Свежесобранное сырье каланхоэ Дегремона представляет собой куски облиственных побегов длиной до 50 см, отдельные листья. Стебли сочные, неопушенные, цилиндрические, темно-зеленого цвета. Нередко на стеблях в узлах имеются придаточные корни. Листья супротивные, черешковые, удлиненно-треугольные, мясистые, сочные, с верхней стороны темно-зеленые, с нижней – светло-зеленые нередко наблюдаются прожилки красно-фиолетового цвета, по краю листья имеют глубокие зубцы красно-фиолетового цвета, в которых, как правило, развиваются новые побеги с листочками и воздушными корнями. В нижней части стеблей, черешков и оснований жилок листьев наблюдается красновато-фиолетовый оттенок. Запах слабый.

Согласно ФС 42-1782-82 «Побеги каланхоэ свежие» побеги каланхоэ перистого свежие представляют собой облиственные побеги длиной от 60|см до 1|м, листья и их части. Стебли сочные, голые, в нижней части цилиндрические, в верхней – четырехгранные; светло-зеленые или серовато-зеленые. Листья супротивные, длинночерешковые, мясистые, сочные; нижние листья эллиптические или яйцевидные, по краю городчатозубчатые; верхние иногда перистые или непарноперистые с 3-5 яйцевидными эллиптическими или удлиненно-эллиптическими, городчатозубчатыми листочками; с верхней стороны зеленые, реже желтоватые или серо-голубоватые от воскового налета или с красноватым от антоциана оттенком, с нижней – сизо-зеленые. Верхушка листа закругленная, основание клиновидное, иногда неравнобокое. Пластинка листа голая, жилкование перистое. По краю листа могут находиться выводковые почки, из которых развиваются молодые растения. В нижней части стеблей, черешков и оснований жилок листьев наблюдается нередко красновато-фиолетовый оттенок. Запах слабый.

Микроскопический анализ сырья каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого

В микропрепарате листа каланхоэ перистого согласно ФС 42-1782-82 «Побеги каланхоэ свежие» должны быть видны: клетки эпидермиса верхней и нижней сторон листа крупные, с извилистыми стенками; устьица с обеих сторон очень мелкие, овальной формы, анизоцитного типа; под верхним эпидермисом – крупные многоугольные клетки субэпидермального слоя, образующие под устьицами крупные межклетники.

Рисунок 1 – Фрагмент эпидермы верхней

стороны листа каланхоэ перистого (20×)

Рисунок 2 – Фрагмент эпидермы верхней

стороны листа каланхоэ Дегремона (20×)

Рисунок 3 – Фрагмент эпидермы нижней стороны листа каланхоэ перистого (20×)

Рисунок 4 – Фрагмент эпидермы нижней стороны листа каланхоэ Дегремона (20×)

В приготовленных микропрепаратах верхней (рис. 1) и нижней (рис. 3) сторон листа каланхоэ перистого видны все вышеуказанные признаки. Описание микроскопии рекомендуем дополнить уточнением: стенки клеток верхней эпидермы менее извилистые, по сравнению со стенками клеток нижней эпидермы.

В микропрепаратах верхней стороны листа каланхоэ Дегремона видны крупные клетки эпидермиса со слабоизвилистыми, почти прямыми стенками, мелкие устьица анизоцитного типа (рис.|2). В микропрепаратах нижней стороны листа – крупные клетки эпидермиса со слабоизвилистыми стенками, мелкие устьица анизоцитного типа (рис. 4).

Рисунок 5 – Устьице верхней стороны листа каланхоэ перистого

Рисунок 6 – Устьице верхней стороны листа каланхоэ Дегремона

Рисунок 7 – Фрагмент эпидермы верхней стороны листа каланхоэ перистого

Рисунок 8 – Фрагмент эпидермы верхней стороны листа каланхоэ Дегремона

В результате исследований архитектуры поверхности с помощью растрового электронного микроскопа (рис. 5-8) выявлено, что кутикула листовой пластинки каланхоэ перистого мелкоскладчатая, покрыта восковыми образованиями цилиндрической формы. Кутикула листьев каланхоэ Дегремона образует крупные складки, более выраженные на нижней стороне листа. Устьица каланхоэ Дегремона погруженные, в отличие от устьиц каланхоэ перистого, которые располагаются выше уровня листовой пластинки.

Товароведческий анализ сырья каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого

При разработке проекта ФС на свежесобранные побеги каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого установлены числовые показатели, характеризующие доброкачественность сырья.

Фитохимический анализ сырья каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, а также хвоща полевого

Разработаны методики качественного определения основной группы БАВ – фенольных соединений, а также проведен их сравнительный анализ в свежесобранных побегах каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого.

Для качественного анализа фенольных соединений в свежесобранных побегах каланхоэ Дегремона и каланхоэ перистого использовали метод ТСХ, имеющий высокую чувствительность и селективность.

Аналитическую пробу сырья измельчали до образования кашицы.В колбу вместимостью 50|мл помещали около 1,0000|г (точная навеска) измельченного сырья, заливали 10|мл этанола 96|%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение30 мин. Испытуемый раствор охлаждали, фильтровали.

В качестве раствора сравнения применяли 1|% растворы СО фенольных соединений: кверцетина, кемпферола, рутина, гиперозида, апигенин-7-гликозида, кофейной, галловой, кумаровой, феруловой, хлорогеновой кислот в метаноле.

Для разделения различных групп фенольных соединений использовали хроматографические пластины «Силикагель 60 F254 Merck». Качественное разделение обеспечивает подвижная фаза (ПФ) этилацетат-уксусная кислота-вода (ЭУВ) (2:1:1). Зоны адсорбции фенольных соединений обнаруживали в УФ-свете при длине волны 365|нм, а также обрабатывали 1|% раствором дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира и 5|% раствороммакрогола 400.

Обнаружены следующие фенольные соединения: рутин, гиперозид, галловая кислота, кофейная кислота, п-кумаровая кислота, кверцетин, кемпферол.

Разработаны методики количественного определения фенольных соединений в сырье каланхоэ Дегремона, каланхоэ перистого, а также проведен сравнительный анализ количественного содержания фенольных соединений в сырье обоих видов; разработаны методики количественного определения фенольных соединений в траве хвоща полевого. Дифференциальный вариант спектрофотометрии позволил исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ, имеющих оптическую плотность в области максимума поглощения извлечений из сырья.

Рисунок 7 – УФ-спектр

фенольных соединений:

1 – кислоты галловой СО;

2 – извлечение из побегов

каланхоэ Дегремона свежих;

3 – растворитель (плацебо)

Рисунок 8 – УФ-спектр

фенольных соединений:

1 – кислоты галловой СО;

2 – извлечение из побегов каланхоэ перистого свежих;

3 – растворитель (плацебо)

Рекомендуем установить норму содержания суммы фенольных соединений в пересчете на кислоту галловую и абсолютно сухое сырье для сырья каланхоэ Дегремона не менее 6,0|%, для сырья каланхоэ перистого не менее 5,0|%.

Метрологические характеристики методик (табл.|1) свидетельствуют, что относительная ошибка единичного определения с 95|% вероятностью не превышает 5,96|% для сырья каланхоэ Дегремона и 1,08|% для сырья каланхоэ перистого.

Таблица 1 – Метрологические характеристики методик количественного определения

Xср

S2

S

Sx

Px

t(P, f)

ΔX

ε, %

Побеги каланхоэ Дегремона свежие

6,489

0,0293

0,1711

0,0541

0,95

2,26

0,3867

5,96

Побеги каланхоэ перистого свежие

5,328

0,00644

0,0802

0,0254

0,95

2,26

0,1814

1,08

Отсутствие систематической ошибки методик подтверждено в опытах с добавками кислоты галловой непосредственно к навеске сырья перед экстракцией (табл. 2). Для подтверждения воспроизводимости разработанных методик проведена их валидация.

Таблица 2 – Результаты опытов с добавками кислоты галловой к сырью

Взято в сырье, г

Добавлено

кислоты

галловой, г

Должно быть, г

Найдено, г

Ошибка

Абсолютная, г

Относительная, %

1

2

3

4

5

6

Побеги каланхоэ Дегремона свежие

0,06489

0,0162225

0,0811

0,0817

+ 0,0006

+ 0,740

0,06489

0,032445

0,0973

0,0968

– 0,0005

– 0,514

0,06489

0,0486675

0,1136

0,1141

+ 0,0005

+ 0,440

0,06489

0,06489

0,1298

0,1292

– 0,0006

– 0,462

Побеги каланхоэ перистого свежие

0,05328

0,01332

0,06660

0,06675

+ 0,00015

+ 0,225

0,05328

0,02664



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | ... | Вперед → | Последняя | Весь текст