Современные клинические и молекулярно-генетические подходы к диа

На правах рукописи

ШЕВЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

СОВРЕМЕННЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.12 — онкология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Новосибирск – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики” Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск, Россия) и Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Новосибирском национальном исследовательском государственном университете

Научные консультанты:

Сидоров Сергей Васильевич

доктор медицинских наук, профессор

Гуляева Людмила Федоровна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Новиков Валерий Александрович

доктор медицинских наук

ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения РАМН,

ведущий научный сотрудник отделения

опухолей головы и шеи

Лебедев Игорь Николаевич

Доктор биологических наук

ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» Сибирского отделения РАМН, руководитель лаборатории цитогенетики

Попов Олег Сергеевич

Доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Сибирский медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ,

профессор кафедры общей хирургии

Ведущая организация: ФГБУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития РФ.

Защита диссертации состоится «___»_________2013 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.032.01 в ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН по адресу 634009 г.Томск, п. Кооперативный, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН

Автореферат разослан «___» _______________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н. , проф. Фролова Ирина Георгиевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак щитовидной железы (РЩЖ) – наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль эндокринных органов [Davies, Welch, 2006; Чиссов и др., 2005]. Доля РЩЖ среди злокачественных опухолей всех локализаций составляет 1-1,5% [Давыдов, Аксель, 2007; Kilfoy et al., 2008]. Ежегодный прирост заболеваемости РЩЖ в различных странах miRа варьирует от 2 до 12% [Netea-Maier R.T. et al., 2008; Sprague B.L. et al., 2008]. В РФ в последние годы заболеваемость РЩЖ лидирует по ежегодным темпам прироста, который в последнее время составляет в среднем 3,5% в год [Чиссов и др., 2007]. Так, в 1998 году в РФ было зарегистрировано около 6,5 тысяч впервые выявленных случаев РЩЖ, а в 2007 году – 8,5 тысяч. Заболеваемость РЩЖ в РФ составляет 6,1 случаев на 100 тыс. населения в год [Чиссов В.И. и др., 2007]. В г. Новосибирске в 2004 г. данный показатель составил 6,5, в 2005 году – 8,7, а в 2010 году уже 8,9 на 100 тысяч населения. Пик заболеваемости РЩЖ по данным различных авторов приходится на возраст 41 – 45 лет, но нередки случаи диагностики злокачественных опухолей щитовидной железы (ЩЖ) в молодом, юношеском и даже детском возрасте. Рак щитовидной железы значительно чаще встречается у женщин (соотношение женщины: мужчины = 3:1), что объясняется особенностями гормонального статуса.

Вопросы этиологии, патогенеза, диагностики, лечения и прогноза больных РЩЖ в последние два десятилетия находятся в фокусе фундаментальных и клинических исследований. Разнообразие гистологических типов РЩЖ отражается на характере клинического «поведения» опухоли, однако даже внутри одного и того же гистологического типа РЩЖ часто наблюдается вариабельность клинического течения и прогноза заболевания.

Последнее десятилетие ознаменовалось значительными успехами в понимании канцерогенеза щитовидной железы на молекулярном уровне. Но, несмотря на то, что некоторые генетические мутации уже описаны, в особенности для папиллярного гистотипа РЩЖ, механизмы, лежащие в основе развития этих новообразований, пока еще далеки от полного понимания. Между тем, для клинической практики большое значение имеет их использование в диагностике, прогнозе и лечении.

Поиск генетических аномалий, обусловливающих наследственную предрасположенность к развитию РЩЖ, является клинически востребованным направлением фундаментальной медицины. В результате таких исследований выявлено, что в этиологии медуллярного рака ЩЖ часто играют роль наследуемые (герминальные) мутации в протоонкогене RET [Machens et al., 2001; Dotto, 2008; Nosé, 2011]. Мутация V600E в гене BRAF в большинстве случаев обнаружена и превалирует в папиллярных карциномах , она также выявляется в анапластических и слабо дифференцированных карциномах, возникающих из папиллярной карциномы [Xing, 2007].

Очевидно, что без изучения молекулярных и генетических причин и механизмов канцерогенеза ЩЖ нельзя ожидать значительного прогресса в диагностике и лечении больных РЩЖ. Речь идет, прежде всего, об исследовании мутаций в специфичных для РЩЖ онкогенах (RET, BRAF), а также инактивации генов-онкосупрессоров (RB1, p16/CDKN2a, p15/CDKN2b, p14/ARF, CDH1 и др.). В последние годы наметилось еще одно направление в ранней диагностике онкологических заболеваний. Это связано с недавним открытием в геноме человека генов, кодирующих регуляторные молекулы – микроРНК, которые негативно регулируют экспрессию многих генов. Показано, что микроРНК участвуют почти во всех биологических процессах в клетке в норме и при разных патологических состояниях. По современным представлениям нарушение экспрессии отдельных микроРНК, регулирующих онкогены и раковые супрессорные гены, является одним из механизмов канцерогенеза. Более того, сами микроРНК могут выступать в роли как онкогенов, так и супрессоров опухолевого роста (Krutovskikh, Herceg, 2010). Более того, они могут быть использованы в качестве биомаркеров в диагностике и прогнозе многих онкозаболеваний (Kosaka et al., 2010), в том числе и при раке щитовидной железы (Marini et al.,2011). В связи с этим, поиск новых маркеров с использованием передовых технологий анализа экспрессии микроРНК для РЩЖ представляется весьма актуальной и перспективной задачей.

В то же время, наряду с прогрессом в молекулярно-генетических исследованиях РЩЖ совершенствуются стандартные и разрабатываются новые клинические подходы. Высокоразрешающие и высокочувствительные методы лучевой и нелучевой диагностики РЩЖ также постоянно улучшаются. Широкое внедрение метода УЗИ в практическое здравоохранение, наблюдаемое в течение последних двух десятилетий, привело к выявлению большого числа карцином ЩЖ на субклинической (непальпируемой) стадии опухоли, потенциал агрессивности которых чрезвычайно неоднороден [Лушников и др., 2003].

Актуальность проблемы является очевидной и свидетельствует о необходимости не только дальнейшего совершенствования существующих методов диагностики, и оценки их эффективности, но и поиска новых достаточно информативных и неинвазивных методов исследования, разработки оптимизированного диагностического алгоритма с целью ранней диагностики опухолей щитовидной железы, а также о необходимости выработки рациональной хирургической и лечебной тактики у больных с этой патологией.

Цель работы: Улучшить диагностику и лечение больных раком щитовидной железы путем разработки и внедрения этиопатогенетических и прогностических подходов, основанных на современных передовых клинических технологиях и достижениях молекулярной биологии и генетики.

Задачи исследования:

Проанализировать фоновую патологию как этиологический фактор возникновения рака щитовидной железы.

Оценить дифференциально-диагностические возможности основных современных методов исследований (ультразвуковой диагностики и тонкоигольной аспирационной биопсии) при опухолях щитовидной железы.

Разработать и внедрить оптимизированный диагностический алгоритм с использованием новых методов исследований (соноэластография, метод компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий) при узловых образованиях щитовидной железы с целью раннего выявления рака щитовидной железы.

Определить показания к выбору вида, объема и характера хирургического вмешательства при разных клинико-морфологических формах опухолей щитовидной железы.

Разработать новые методы диагностики новообразований щитовидной железы с применением генетических онкомаркеров BRAF и GSTP.

Провести анализ ферментов метаболизма ксенобиотиков CYP1A1, CYP1A2, CYP19 и SULT1A1 у больных раком щитовидной железы для выявления групп повышенного онкологического риска.

Определить экспрессию микроРНК ( miR21, miR221, miR222, miR155 и miR205) в новообразованиях щитовидной железы для диагностики злокачественного процесса.

Научная новизна работы

Впервые РЩЖ изучался не только с точки зрения особенностей клинического течения гистологических типов, но и с современных молекулярно-генетических позиций. На достаточном по численности клиническом материале проанализирована фоновая патология ЩЖ, как этиологический комплекс факторов возникновения РЩЖ. Показано, что наиболее частыми предопухолевыми изменениями были коллоидный зоб (37,91%), токсический зоб (20,88%), аденомы (10,99%) и аутоиммунный тиреоидит (10,99%).

С целью улучшения дооперационного выявления РЩЖ, автором впервые проанализированы и систематизированы данные традиционных исследований, а также внедрены новые методы лучевой диагностики (соноэластография), что позволило повысить диагностическую точность ультразвукового исследования при узловой патологии щитовидной железы. Чувствительность соноэластографии для выявления рака щитовидной железы составила 90%, специфичность – 93,7%, диагностическая точность – 92,9%.

В алгоритме дифференциальной диагностики фолликулярного РЩЖ внедрен метод компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий, что позволило повысить диагностику с чувствительностью до 92%, с сокращением времени исследования с 30 мин до 5 мин и исключить зависимость результата от квалификации врача.

Разработаны и внедрены новые подходы к тактике хирургического лечения больных РЩЖ, заключающиеся в определении объема операции на пораженном органе и вмешательствах на зонах регионарного метастазирования.

Впервые в Сибирском регионе проведен анализ соматической мутации V600E в онкогене BRAF при спорадическом папиллярном РЩЖ. Установлено, что данная мутация регистрируется в 64 % опухолей щитовидной железы.

Впервые исследована экспрессия гена и ферментативная активность ГSТР1-1 в тканях щитовидной железы. Показано 2-3-х кратное повышение активности ГSТР1-1 и экспрессии ее гена в доброкачественных опухолевых тканях и 1,5-3-х кратное снижение в тканях карциномы ЩЖ. Впервые ГSТР1-1 исследован как потенциальный онкомаркер для папиллярного РЩЖ.

Впервые проведен анализ генетического полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков у женщин с заболеваниями ЩЖ. Показано, что женщины, носители дикого аллеля G и генотипа G\G сульфотрансферазы SULT1А1 имеют повышенный риск развития рака щитовидной железы с отношением шансов ОШ=0,38 (р=0,0004) и ОШ=0,11 (р=0,0013) соответственно.

При узловой патологии ЩЖ впервые исследовалась экспрессия микроРНК и показана перспективность разрабатываемого подхода в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных образований. Установлено, что экспрессия miR-21, miR-221 и miR-222 достоверно увеличивается более, чем в 5 раз в 50-85% случаев рака щитовидной железы.

Практическая значимость

Большой по объему клинический материал позволил изучить проблему РЩЖ на современном научно-доказательном уровне. Проанализировано влияние фоновой патологии на вероятность возникновения дифференцированного РЩЖ, что является важным аспектом тактики ведения больных в клинической практике, включающей формирование групп риска с последующим углубленным обследованием.

Уточнены и систематизированы возможности существующих ультразвуковых методов диагностики РЩЖ. В дополнение к традиционным внедрен новый метод – соноэластография. В результате комплексного анализа с помощью данной методики усовершенствованы дифференциально-диагностические алгоритмы выявления злокачественных опухолей при узловой патологии ЩЖ, позволяющие повысить диагностическую точность до 92,9%. со специфичностью 93,7%.

Применение метода компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий значительно повысило чувствительность ТАПБ при фолликулярном РЩЖ, что может определять дальнейшую тактику лечения узловой патологии щитовидной железы при цитологическом диагнозе «фолликулярная опухоль».

Выявление соматической мутации V600E в онкогене BRAF в пунктате и смыве пункционной иглы позволило улучшить информативность ТАПБ при спорадическом папиллярном РЩЖ, а также определить тактику лечения.

Методами анализа генетического полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков у женщин показано, что носители дикого аллеля G и генотипа G\G сульфотрансферазы SULT1А1 имеют повышенный риск развития рака щитовидной железы по сравнению с носителями мутантного генотипа G→A в позиции 638, что может явиться важным аргументов в скрининге населения для формирования групп риска

Анализ профиля экспрессии микроРНК miR-21, miR-221 и miR-222 в узловых образованиях ЩЖ выявил специфические и перекрывающиеся профили в разных типах опухолей. Показана перспективность данного подхода для создания новых методов ранней диагностики РЩЖ.

Изучение закономерностей частоты и обширности регионарной диссеминации ПРЩЖ позволили определить показания и оптимизировать выбор объема регионарной лимфодиссекции с учетом различных факторов, оказывающих независимое влияние на риск прогрессирования. В хирургическую практику внедрен метод интраоперационной диагностики «сторожевого» лимфоузла, метод определения инвазии опухоли за собственную капсулу в свободную тиреоидную ткань, что позволяет оптимизировать дальнейшую тактику операции.

Таким образом, в результате проведенного исследования разработаны и внедрены новые подходы к диагностике и лечению больных дифференцированными гистологическими формами РЩЖ. Положения, выносимые на защиту:

С целью улучшения диагностики РЩЖ включать в дополнение к общепринятому алгоритму обследования новые клинические методы, такие как соноэластография и метод компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий, повышающий информативность цитологической дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей щитовидной железы.

Эффективность хирургического лечения РЩЖ определяется адекватным характером операции на пораженном органе и зонах регионарного метастазирования. Объем операции зависит не только от размера и инвазивных свойств первичной опухоли, но и от локализации последней в щитовидной железе. Интраоперационная лимфография с целью поиска «сторожевого» лимфоузла позволяет также обосновать необходимость хирургического вмешательства на органе и зонах ближайшего регионарного метастазирования.

Применение новых молекулярно-генетических методов, таких как:

— определение соматической мутации V600E в онкогене BRAF в пунктате узла щитовидной железы;

— определение экспрессии гена и ферментативной активности ГSTP в опухолевых тканях щитовидной железы;

— анализ генетического полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков с выявлением женщин, несущих дикий аллель G в позиции 638 и дикий генотип G/G гена SULT1A1;

— определение экспрессии микроРНК miR-21, miR-221 и miR-222 в тканях тиреоидной карциномы;

позволяет повысить точность существующих методов диагностики РЩЖ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Опухоли головы и шеи» (Анапа, Россия, май 2006), Первый украино-российский симпозиум по эндокринной хирургии с международным участием «Современные аспекты эндокринной патологии» (Киев, Украина, 2006), VIII Дальневосточная онкологическая конференция «Современные возможности и актуальные проблемы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Владивосток, Россия, сентябрь 2006), Межрегиональная конференция с международным участием «Рак щитовидной железы и эндемический зоб» (Екатеринбург, Россия, апрель 2007), Международный научный симпозиум «Малоинвазивные технологии в эндокринной хирургии» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), Международный конгресс по онкологической хирургии (Краснодар, Россия, 2008), Российская научно-практическая конференция с международным участием «Совершенствование онкологической помощи в современных условиях» (Барнаул, Россия, 2008), Международный научный форум «Рак щитовидной железы: современные принципы диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, Россия, 2009), Международный научный форум «Патология околощитовидных желез: современные принципы диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, Россия, 2010), Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Достижения современной онкологии» (Барнаул, Россия, 2010), XIX Российский симпозиум с международным участием «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (Челябинск, Россия, 2010), IV Международный конгресс «Опухоли головы и шеи» (Иркутск, Россия, 2011), II Украино-российский симпозиум «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (Харьков, Украина, 2011). XX Российский симпозиум с международным участием «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (Казань, Россия, 2012).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ, из которых 15 – статьи в рецензируемых журналах перечня ВАК.

Структура работы: Диссертация построена по традиционному плану, содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложения. Рукопись содержит 25 таблиц, 51 рисунок. В списке литературы 429 источника. Общий объем работы — 258 \pages страниц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе проанализирован накопленный в клинике МБУЗ г.Новосибирска «Городская клиническая больница №1» опыт диагностики и лечения больных РЩЖ, а также результаты совместных исследований с цитологической лабораторией Дорожной клинической больницы на Ст.Новосибирск-Главный ОАО «РЖД», с ФГБУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, а также с ФГБУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН. Всего в эксперимент было взят 901 пациент с новообразованиями щитовидной железы с соотношением женщины : мужчины 801:100. Средний возраст составлял 47±30 лет. Количество больных со злокачественными опухолями щитовидной железы было 687 (75,5 %), с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы – 214 (24,5%) человек. Онкологическая патология ЩЖ была представлена, в основном, дифференцированными формами рака (ПРЩЖ и ФРЩЖ), что составило 95% от всех видов злокачественных опухолей, включенных в исследование. Больные с диагнозом рак щитовидной железы на момент исследования имели преимущественно стадию I (45%) или II (50%). Больные с экстратиреоидным распространением процесса составляли 5% случаев. Доброкачественные процессы ЩЖ представлены различными видами аденом, аутоиммунным тиреоидитом, ДУЗ.

Из 901 пациентов, включенных в исследование было оперировано 746 человек, что составило 82,8%. По поводу рака щитовидной железы прооперировано 578 больных (77,5%), по поводу доброкачественных новообразований – 168 (22,5%). Операцией выбора при раке щитовидной железы была тиреоидэктомия – 526 больных (91%). 42 (9%) пациентам выполнена гемитиреоидэктомия. В 33% случаев операции по поводу РЩЖ сопровождались тем или иным вариантом лимфодиссекции.

Остальным 155 (17,2%) пациентам, исходя из характера патологического процесса в щитовидной железе, оперативное лечение не было показано. Им было рекомендовано динамическое наблюдение.

Исследования соответствовали рекомендациям стандартов этического комитета, принятым в Российской Федерации, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека», поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие.

Для исследования фоновой патологии, как прогностического фактора заболеваемости РЩЖ выполнен анализ 247 историй болезни пациентов, пролеченных а по поводу рака щитовидной железы в период с 2005 по 2007 год включительно. Диагноз РЩЖ установлен на основании планового гистологического исследования, проведенного в патоморфологическом отделении больницы. На дооперационном этапе использовали исследование уровней гормонов (Т3, Т4, ТТГ,), ультразвуковое исследование ЩЖ, тонкоигольную аспирационную биопсию под контролем УЗИ, сцинтиграфию. Всем больным выполнено послеоперационное плановое гистологическое исследование.

Из всех применяемых в настоящее время методов лучевой диагностики анализировались результаты ультразвукового обследования из лечебных учреждений, направивших больных для оперативного лечения в МБУЗ г. Новосибирска «ГКБ № 1».. Оценивали следующие УЗИ-признаки РЩЖ: гипоэхогенность новообразований; негомогенность эхоструктуры; наличие микрокальцинатов; неровность контуров; интранодулярный кровоток; наличие гипоэхогенного ободка.

Соноэластография проводилась на ультразвуковом сканере «HITACHI EUB-8500» линейным высокочастотным датчиком с частотой 8-12 МГц.

Для компьютерного анализа цитологических и гистологических препаратов использовали систему анализа изображений (САИ), состоящую из микроскопа проходящего света «AxioStar+» (Carl Zeiss, Germany), компьютера Pentium IV IBM, цветной цифровой видеокамеры Axiocam (Carl Zeiss, Germany) и программы Axio Vision 3.1.

Для решения задач дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей с помощью нейросетевых технологий использовали многослойные нейронные сети, обученные при помощи алгоритма обратного распространения ошибки (Тарков М.С. и др., 2007). Моделирование нейронной сети осуществляли при помощи специально созданного для этих целей на языке «С++» нейроимитатора «НЕЙРОКЛАСС» (регистрационный № 2006612844, фирма МИКРОМЕД), работающего в среде MS Windows 95, 98, 2000, NT, XP, позволяющего моделировать различные архитектуры искусственных нейронных сетей, обучать их и тестировать. Выходом сети был диагноз: фолликулярный рак и фолликулярная аденома.

Для лечения РЩЖ использовали традиционные хирургические подходы с учетом ультразвуковых характеристик узла, результатов дооперационного цитологического исследования и интраоперационных данных.

Соматическую мутацию в гене BRAF V600E (Т1799А) в опухолевых образцах щитовидной железы определяли методом аллель-специфичной амплификации в режиме реального времени. ПЦР проводили в стандартном буфере. Полученные результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивали с помощью кривой плавления.

Генотипирование женщин проводили методом ПДРФ-анализа продуктов ПЦР с использованием подобранных праймеров и соответствующих ферментов рестрикции: для MspI для CYP1A1; ApaI для CYP1A2; SfaNI для CYP19; HhaI для SULT1A1. Геномную ДНК выделяли методом высоко-солевого осаждения белков из буккального эпителия больных и здоровых женщин. Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы SISA (http://home.clara.net/sisa/). В качестве критерия, определяющего, является ли исследуемый признак фактором риска заболевания, было использовано отношение шансов (odds ratio, или ОШ).

Экспрессия гена hGSTP1-1 была определена методом мультиплексной ОТ-ПЦР на амплификаторе Терцик (Компания «ДНК Технологии», Россия). Содержание мРНК hGSТР1оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы исследуемых генов к интенсивности полосы гена домашнего хозяйства GAPDH. Для определения ферментативной активности hGSTP1-1выделяли цитозольную фракцию щитовидной железы. В качестве субстрата использовали этакриновую кислоту. Продукты реакции были разделены методом ВЭЖХ с использованием автоматизированного комплекса Altex, который включал два насоса Beckman 110B, системный контроллер Beckman 420 (США) и был доукомплектован детектором с переменной длиной волны SpectroMonitor3100 (LDS Analytical, Англия), самописцем Pharmacia (Швеция), а также компьютером, оснащенным программой GME712 для количественной оценки хроматографических пиков.

Для определения количества микроРНК использовали опухолевую ткань щитовидной железы, удаленную в ходе хирургического вмешательства. В качестве контроля служила прилегающая к опухоли нормальная ткань. Забор образцов и их характеристика проводились под контролем врача. Для определения уровня экспрессии miRНК 21, 221, 222, 155, 205 проводили ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories). В качестве внутреннего контроля использовали малую РНК U6, которая стабильно экспрессируется как в норме, так и в опухоли. Изменение количества miRНК в опытном образце по отношению к контрольному вычисляли по формуле: 2-ΔΔCt, где ΔΔCt = (CtmiR – CtU6)опытный обр. – (CtmiR – CtU6)контр. обр.Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программ Statistica 6.0. и ORIGIN Pro 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время не вызывает сомнения, что успех в диагностике и лечении онкологических заболеваний, в том числе и РЩЖ, зависит от комплексного подхода с применением существующих передовых клинических и молекулярно-генетических методов.

Фоновая патология ЩЖ, как прогностический фактор заболеваемости РЩЖ

Выполнен анализ 247 пациентов, оперированных по поводу РЩЖ, из них женщин – 218 (88,3%), мужчин – 29 (11,7%) . Соотношение м : ж = 1 : 7,5. Возраст больных составил: у женщин от 17 до 78 лет и у мужчин от 25 до 66 лет. пик заболеваемости приходится на возраст от 50 до 59 лет, что может явиться основанием для включения этого возрастного контингента в группу риска.

Выявлено, что наиболее частой фоновой патологией являются: коллоидный зоб, токсический зоб, аденомы, аутоиммунный тиреоидит и фолликулярные опухоли. Обращают на себя внимание несколько важных моментов.

Процент аденоматозных изменений в ткани ЩЖ – 10,99%. Небольшой процент объясняется тем, что в последние годы диагноз «аденома» считается облигатным предраковым заболеванием и принятой во всем мире агрессивной тактикой при установлении данного диагноза. Таким образом, удельный вес РЩЖ на фоне аденом резко снизился.

Результаты исследования показывают, что в 20,88% случаях РЩЖ развивается на фоне тиреотоксических изменений. Следует отметить, что не во всех случаях диагноз тиреотоксического процесса сопровождался клинической картиной, и даже лабораторными изменениями. Это результаты гистологической диагностики и соответственно диагноз тиреотоксикоза не был установлен до оперативного лечения.

Следует обратить внимание на данные, полученные по поводу коллоидного зоба, который в 37,91% явился фоном РЩЖ. Столь большие цифры можно объяснить как региональными особенностями развития РЩЖ, так, вероятно, и методами статистической обработке данных. Многие авторы исходят из того, сколько выявлено РЩЖ среди всех пациентов с коллоидным зобом. Мы же, в свою очередь, исходили из прямо противоположного: какой процент коллоидного зоба является фоновой патологией при РЩЖ.

Методы УЗИ исследования как этап дооперационной диагностики рака щитовидной железы

Проведен анализ информативности лучевых методов диагностики и оценки распространенности РЩЖ (ультразвуковое исследование, соноэластография).

Режим серой шкалы

Установлено, что эхоструктурные характеристики отличаются широкой вариабельностью. Определены специфические эхографические характеристики (гипоэхогенность образований, негамогенность эхоструктуры, наличие микрокальцинатов, неровность контуров, интранодулярный кровоток, наличие гипоэхогенного ободка).

При ретроспективном анализе гистологического послеоперационного материала выявлено: 1) у 36 пациентов диагноз РЩЖ был подтвержден (64,3%); 2) у 6 больных отмечен ложноотрицательный результат (10,7%); 3) у 14 больных предположение по УЗИ-признакам о РЩЖ не подтвердилось (25,0%).

Из числа подтвержденных гистологически (42 случая РЩЖ) частота встречаемости анализируемых УЗИ-признаков распределилась следующим образом: 1) ипоэхогенность образований – 14; 2) негомогенность эхоструктуры – 8; 3) наличие микрокальцинатов – 6; 4) неровность контуров – 5; 5) интранодулярный кровоток – 2; 6) наличие гипоэхогенного ободка – 1. наиболее часто встречаемыми УЗИ-признаками РЩЖ являются: гипоэхогенность образований, негомогенность эхоструктуры и наличие микрокальцинатов. Неровность контуров ЩЖ также необходимо отнести к симптому РЩЖ, которая встречается достаточно часто (13,9%). В то же время, такие признаки, как интранодулярный кровоток и гипоэхогенный ободок регистрируются достаточно редко. Следует заметить, что при проведении УЗИ-анализа ЩЖ эти признаки часто сочетаются. Для оценки таких сочетаний был проведен математический анализ Парето: гипоэхогенность новообразований, негомогенность эхоструктуры, наличие микрокальцинатов являются существенно важными факторами, при сочетании которых диагностическая ценность составляет 77,8%.

Соноэластография

Для оценки жесткости (эластичности) узловых образований наряду с УЗИ щитовидной железы с оценкой ЦДК, проводили «виртуальную пальпацию» с получением изображения деформации в зоне интереса в виде цветового кодирования на экране и оценки коэффициента жесткости. В ходе нашей работы мы обнаружили, что многие опухоли окрашиваются в соноэластографическом режиме неоднородно, и коэффициент жесткости в разных участках одного новообразования может различаться. Это связано с неоднородностью популяции клеток опухоли. Согласно данным гистологических заключений, у прооперированных пациентов было выявлено 10 случаев рака ЩЖ и 4 — доброкачественной патологии. По данным соноэластографии в данной группе оказалось 1 ложноотрицательное заключение (КЖ<3, гистологически выявлен рак) и 2 ложноположительных (КЖ>3, гистологически рака нет), 9 истинно положительных результатов (КЖ>3, гистологически рак подтвержден) и 2 истинно отрицательных (КЖ<3, гистологически рака нет). В группе пациентов, которым оперативное лечение показано не было (28 случаев), все результаты СЭГ были отрицательны (КЖ<3). Чувствительность метода составила 90%, специфичность – 93,7%, диагностическая точность – 92,9%.

Таким образом, метод соноэластографии можно использовать для динамического наблюдения пациентов с уже имеющимися узлами ЩЖ. СЭГ является неинвазивным методом диагностики, ее рекомендовано проводить одновременно с УЗИ, повышая информативность обследования. Известно также, что клеточный пул опухоли неоднороден, и при тонкоигольной аспирационной биопсии в пунктат могут не попасть злокачественные клетки. В таких случаях СЭГ можно использовать как дополнительный метод диагностики.

На основании проведенного анализа можно вывести следующие соноэластографические критерии рака ЩЖ: 1) окрашивание исследуемого образования в режиме СЭГ в синие тона; 2) значение коэффициента жесткости более 3 единиц.

При сочетании клинических и соноэластографических признаков рака ЩЖ (даже при отсутствии цитологического подтверждения злокачественной опухоли по ТАБ) мы предлагаем рассматривать данное узловое новообразование как злокачественное и выставлять больным показания к хирургическому лечению. Предлагаем ввести следующий алгоритм действий в случае, когда данные ТАБ малоинформативны или сомнительны (рис. 1).

SHAPE \* MERGEFORMAT

Рисунок 1 — Предлагаемая тактика при малоинформативных или сомнительных результатах ТАБ.

Учитывая высокую информативность СЭГ (по данным нашего исследования диагностическая точность составляет 93%), данный метод, не являясь альтернативой морфологическому исследованию (ТАБ), в совокупности с другими данными, улучшает диагностику злокачественного процесса в щитовидной железе.

Метод компьютерного анализа изображений и нейросетевых технологий для дооперационной диагностики РЩЖ при цитологическом заключении «фолликулярная опухоль»

Для решения задачи дифференциальной цитологической диагностики фолликулярного рака и аденомы ЩЖ в материале ТАБ была применена нейросетевая технология и автоматический анализ изображений цитологических образцов опухоли, полученных с использованием системы анализа изображений [Полоз и др., 2006; Тарков и др., 2007; Shapiro et al., 2007].

В качестве диагностирующей системы, разбивающей множество изображений на два класса («аденома» и «фолликулярный рак»), использовали двуслойную нейронную сеть. Применение нейросетевого анализатора «НЕЙРОКЛАСС [Полоз и др., 2007; Шкурупий, 2009], обученного на примерах изображений опухолей, полученных с использованием компьютерной системы анализа изображений и прошедшего предварительное тестирование способно значительно повысить диагностическую ценность цитологического метода исследования фолликулярных опухолей ЩЖ, как в пункционном материале, так и при интраоперационном исследовании, благодаря своей быстроте и высокой чувствительности.

В исследовании в качестве тестовых использовали изображения трех полей зрения 44 фолликулярных аденом и 40 фолликулярных раков с установленным гистологическим диагнозом. В результате тестирования 80 из 84 примеров были диагностированы правильно, что составило 95% совпадения с гистологическими диагнозами.

Актуальность использования нейросетевого метода классификации изображений фолликулярных опухолей обусловлена трудностями дифференциальной диагностики этих новообразований, высокой ответственностью и «ценой» принятого решения. Проведенное исследование показало, что использование нейросетевой технологии может значительно повысить чувствительность метода дооперационной цитологической диагностики фолликулярных опухолей ЩЖ (до 95%), за счет унифицирования и стандартизации способа диагностики, исключающего компонент субъективизма при автоматическом распознавании серии цветных цифровых изображений образцов при этих патологических процессах.

Интраоперационная тактика определения объема хирургического вмешательства на щитовидной железе и зонах регионарного метастазирования при ДРЩЖ

Определение объема операции на ЩЖ и зонах регионарного метастазирования при РЩЖ является актуальной задачей. В результате исследования были использованы следующие подходы.

Определение объема операции на ЩЖ

Согласно современной тактике хирургического лечения РЩЖ операцией выбора на органе является тиреоидэктомия. Органосохраняющие операции возможны только в строго определенных случаях (размеры опухоли по символу Т1 и отсутствие экстратиреоидной распространенности процесса). Однако в реальной жизни хирург часто сталкивается с вопросами необходимости расширения объема операции до тиреоидэктомии при раках малых размеров (микрокарциномы). Проведен анализ интраоперационного гистологического исследования инвазии опухоли ЩЖ за собственную капсулу (если такая имеется) в свободную тиреоидную ткань.

Во всех анализируемых случаях (7 пациентов с диагнозом папиллярный рак щитовидной железы) при срочном гистологическом исследовании препарата выявлена инвазия раковых клеток за собственную капсулу опухоли в свободную тиреоидную ткань. Это определило изменение интраоперационной тактики – удаление оставшейся части щитовидной железы (т.е. объем операции – тиреиодэктомия). При плановом гистологическом исследовании, во всех случаях в предполагаемом тиреоидном остатке, обнаружены микрофокусы папиллярного рака.

Таким образом, при выполнении органосберегающей операции (гемитиреоидэктомия с перешейком) при микрокарциномах (не более T1) папиллярного рака, необходимо срочное интраоперационное гистологическое исследование состояния капсулы опухоли. При выявлении инвазии последней опухолевыми клетками в свободную тиреоидную ткань необходимо расширять объем операции до тиреоидэктомии.

Определение тактики на зонах регионарного метастазирования при ЩЖ

В случае подтвержденных метастатических изменений в лимфоузлах шеи не вызывает вопросов необходимость их диссекции. Однако выполнение диссекции в превентивном варианте (в случае субклинического поражения) является предметом многочисленных дискуссий. Особенно это касается YI-го уровня регионарного метастазирования (центральная клетчатка шеи).

Проанализированы результаты оперативного вмешательства у 90 пациентов. Всем больным выполнялась тиреоидэктомия по поводу ДРЩЖ, которая дополнялась диссекцией центральной клетчатки шеи в превентивном варианте.

После завершения гистологического исследования выявлено, что папиллярный рак встречался в 78 случаях (86,7%), фолликулярный – в 12 (13,3%). В 58,9 % случаев (53 пациента) отмечено метастатическое поражение лимфоузлов центральной клетчатки шеи. При анализе этих групп по гистологическому варианту опухоли выявлено: фолликулярного рака 16,7% (2 больных из 12); папиллярного рака 65,4% (51 пациент из 78).

Таким образом, необходимость превентивной ДЦКШ при фолликулярном раке щитовидной железы без применения дополнительных интраоперационных методов исследования подвергается сомнению.

У 24 пациентов мы проанализировали частоту метастатического поражения в лимфоузлы ЦКШ папиллярного рака в зависимости от локализации опухоли в доле (Рис. 2).

Рисунок 2 — Частота метастазирования в ЦКШ в зависимости от

локализации опухоли в доле.

Выявлена следующая закономерность: при локализации опухоли только в верхнем полюсе доли (2 случая) метастазов центральной клетчатки не найдено; при опухоли в средней трети метастазы выявлены в 84,6 % (11 случаев из 13); в нижней трети – 77,8 % (7 случаев из 9). У остальных 24 пациентов опухоль занимала больше чем треть доли. Они исключены из анализа для объективизации исследования по данной характеристике.

Рисунок 3 — Частота метастазирования в ЦКШ в зависимости от

характера опухоли по символу Т.

При исследовании частоты метастазирования в ЦКШ в зависимости от характера опухоли по символу Т (ТNМ от 2002 г.) выявлена следующая закономерность (Рис. 3): при Т1 наблюдается 40 % метастазирования (10 случаев из 25); при Т2 – 64,1 % (25 случаев из 39); при Т3, Т4 – 92,9 % (13 случав из 14).

С целью дополнительной интраоперационной диагностики у 14 пациентов было применено интраоперационное контрастирование (Рис. 4).

А

В

Рисунок 4 — Методика выполнения интраоперационной лимфографии.

А – введение лимфотропного красителя паранодулярно. В – окончательный результат лимфографии (окрашен сторожевой лимфоузел). Использован краситель Blue Patente V Sodique Guberber 2,5% (France).

У 7 больных (50%) были выявлены метастазы в «сторожевом» узле и при последующем гистологическом исследовании в «несторожевых» лимфоузлах центральной клетчатки шеи. У 6 пациентов (42,9%) метастазы отсутствовали в обеих группах, в одном случае (7,1%) имелся ложноотрицательный результат (отсутствие метастаза в «сторожевом» лимфоузле и их наличие в «несторожевых»). Общая информативность данного исследования составила 92,9%.

Собственные результаты специфических осложнений после выполнения ДЦКШ приведены в табл. 1. Группа А (20 чел.): выполнена тиреоидэктомия с диссекцией центральной клетчатки шеи. Группа В (20 чел.): выполнена тиреоидэктомия. Оценивались следующие параметры: нарушение фонации, жалобы на чувство дискомфорта, боли в области операции, уровень кальция крови.

Согласно таблице, односторонний парез гортани встречался одинаково часто в обеих сравниваемых группах, причем его частота не превышала 10%, тогда как двустороннего пареза гортани практически не регистрировался. Средний уровень кальция в крови в раннем послеоперационном периоде был снижен в обеих группах, что связано с объемом проведенной операции. Однако через год этот показатель возвращался к норме. Дискомфорт, боли в области шеи отмечались только в раннем послеоперационном периоде, что можно объяснить реакцией организма на раневую боль. Через год пациенты обеих групп практически не предъявляли жалоб.

Таблица 1

Послеоперационные осложнения у пациентов, оперированных по поводу ДРЩЖ

Осложнения

Группа А

Группа В

Через 10 дней после операции

Через 1 год после операции

Через 10 дней после операции

Через 1 год после операции

Односторонний парез гортани

2 (10%)

1 (5%)

2 (10%)

2 (10%)

Двусторонний парез гортани

1 (5%)

Средний уровень кальция в крови (моль/л)

2,0

2,2

2,1

2,35

Дискомфорт, боли в области шеи

11 (55%)

1 (5%)

10 (50%)

Группа А – тиреоидэктомия с диссекцией центральной клетчатки шеи;

Группа В – тиреоидэктомия.

Таким образом, учитывая высокую частоту субклинического метастатического поражения лимфоузлов центральной клетчатки шеи, можно рекомендовать её диссекцию в превентивном варианте при папиллярном раке щитовидной железы T3, T4 и локализации опухоли в средней и нижней трети доли. Во всех остальных случаях папиллярного РЩЖ, а также при фолликулярном гистологическом варианте, показания к проведению превентивной диссекции центральной клетчатки шеи должны выставляться по результатам интраоперационного исследования «сторожевых» лимфатических узлов, выявленных методом лимфографии.

Анализ послеоперационных осложнений показал, что диссекция центральной клетчатки шеи не увеличивает частоту их возникновения и, следовательно, не ухудшает качество жизни пациентов.

Молекулярно-биологические аспекты диагностики рака щитовидной железы

В последние годы достигнуты значительные успехи в исследовании молекулярно-генетических механизмов канцерогенеза щитовидной железы. Однако несмотря на то, что некоторые генетические мутации уже используются для диагностики, в особенности для папиллярного гистотипа РЩЖ, многие вопросы, касающиеся поиска новых специфичных онкомаркеров РЩЖ, а также возможность их применения в клинической практике для диагностики, лечения и определения прогноза заболеваний остаются нерешенными.

Определение соматической мутации BRAF Т1799А (V600Е) в опухолях щитовидной железы

Определение мутации в гене BRAF проводилось в 107 образцах аспиратов из узловых новообразований щитовидной железы и в 47 образцах интраоперационных биоптатов пациентов с папиллярной карциномой. Мутация в гене BRAF в позиции Т1799А, ведущая к замене V600E в последовательности белка, в большинстве случаев обнаружена и превалирует в папиллярных карциномах с классической гистологией с высокой частотой: до 83% [Lima et al., 2004; Nikiforova et al., 2004]. Она также выявляется в анапластических и слабо дифференцированных карциномах, возникающих из папиллярной карциномы [Xing, 2007]. Такая мутация не найдена в фолликулярной карциноме и доброкачественных узлах ЩЖ и, таким образом, может служить специфическим маркером папиллярной карциномы. При исследовании пункционных биоптатов частота соматической мутации гена BRAF в группе с цитологическим диагнозом папиллярной карциномы составила 62,5% (Табл. 2), что соответствует аналогичному показателю для регионов со спорадической заболеваемостью папиллярной карциномой (29-63%) [Kebebew et al., 2007; Henderson et al., 2009].



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст