Совершенствование технологии пивного сусла на основе активации г

На правах рукописи

ЛЫСЮК ВАСИЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПИВНОГО СУСЛА

НА ОСНОВЕ АКТИВАЦИИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ

ПРЕПАРАТОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Специальность: 05.18.07 —

Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва – 2011Работа выполнена на кафедре «Процессы ферментации и промышленного биокатализа» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Гернет Марина Васильевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Иванова Людмила Афанасьевна

кандидат технических наук,

Кобелев Константин Викторович

Ведущая организация:ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления имени К.Г. Разумовского»

Защита состоится декабря 2011 года в ___ часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, 11, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП». Автореферат отправлен по адресу [email protected] для размещения в сети Интернет Министерством образования и науки РФ и размещен на сайте www.mgupp.ru.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, г.Москва, Волоколамское шоссе, 11, МГУПП, ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь

Совета к.т.н. Тимофеев Д.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Пиво является популярным напитком во всем мире, в т. ч. и в России. Несмотря на то, что в последние годы темпы роста его производства несколько снизились, пиво остается продуктом повышенного потребительского спроса. Развитие пивоваренной отрасли направлено на интенсификацию технологического процесса, повышение качества готовой продукции и снижение затрат на ее производство.

Производство пива – совокупность сложных процессов, тесно связанных между собой. Это биохимические превращения компонентов зерна при солодоращении, многообразные ферментативные превращения при получении сусла, метаболизм дрожжей при брожении и дображивании.

На основании углубленных исследований о биохимических реакциях, протекающих на стадии солодоращения и получения пивного сусла, обоснована целесообразность применения в производстве пива гидролитических ферментных препаратов(ФП) микробного происхождения, как компенсация недостаточной ферментативной активности солодов пониженного качества и при частичной замене солода на более дешевое, чем солод, несоложеное сырье.

С учетом относительно высокой стоимости ФП актуальными являются исследования, направленные на повышение эффективности их применения в технологии пивного сусла на основе разработки способов активации ФП и повышения их функциональной и операционной стабильности, внедрение которых позволит уменьшить дозировку ферментных препаратов, интенсифицировать технологический процесс при увеличении выхода экстракта и будет способствовать более полному использованию сырья.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: научное обоснование, разработка и применение способов активации микробных ферментных препаратов (на примере ФП Laminex BG глюканазного действия, амилазы Альфалад БН и мультэнзимной композиции на их основе) для интенсификации процессов биокатализа в технологии пивного сусла.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

● На основании кинетических исследований обосновать выбор С7-алкилоксибензола (С7-АОБ), относящегося к природным структурным модификаторам белков, для применения в качестве активатора промышленных ФП микробного происхождения.

● Исследовать влияние С7-АОБ на ферментативную активность (ФА) ФП Laminex BG, его функциональную и операционную стабильность.

● Разработать условия предварительной активации ФП Laminex BG в присутствии С7-АОБ для интенсификации биокаталитических процессов в технологии пивного сусла.

● Обосновать целесообразность формирования мультэнзимной композиции (МЭК) на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН и провести оптимизацию состава МЭК с использованием униформ – ротатабельных планов эксперимента.

● Дать сравнительную оценку физико–химических показателей качества пивного сусла, полученного по традиционной технологии и при использовании на стадии затирания активированных ФП.

● Провести исследования для характеристики пивного сусла по содержанию белка и его фракционного состава.

● Провести опытно–промышленную апробацию применения разработанных способов активации ФП при получении пивного сусла для оценки физико–химических показателей в сравнении с традиционной технологией.

● Разработать принципиальную технологическую схему и технологические рекомендации по применению предварительной активации исследованных гидролитических ФП для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов.

Научная новизна.

На основании исследования кинетики ферментативной реакции (на примере гидролиза целлюлозы ФП Laminex BG) установлено, что С7-АОБ, влияет на характер зависимости начальной скорости реакции (Vo) от концентрации фермента [Е] и субстрата [S], способствует увеличению максимальной скорости ферментативной реакции (Vmax) более, чем в 2 раза, и не изменяет при этом другой кинетический параметр ферментативного процесса – константу Михаэлиса (Km), что позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ – фермент, как неконкурентную активацию, вследствие конформационных изменений белка фермента.

Доказано эффективное стабилизирующее действие С7-АОБ на гидролитические ФП микробного происхождения в широком диапазоне рН и термературы биокатализа и показано увеличение рН- и термостабильности ФП при сохранении эффекта активации в процессе биокатализа.

Выявлены условия предварительной инкубации промышленных ФП микробного происхождения (температура, продолжительность, концентрация С7-АОБ) для повышения их функциональной активности при гидролизе крахмальных и некрахмальных полисахаридов при получении пивного сусла.

Исследованиями с использованием метода гель-фильтрации показано, что применение на стадии затирания зернопродуктов активированной МЭК приводит к изменению соотношения белковых фракций в сусле: уменьшается содержание фракции высокомолекулярных белков с молекулярной массой ≥ 100000, увеличивается доля фракции с молекулярной массой 15000 – 37000, что является существенным фактором для повышения коллоидной стабильности пива и его пеностойкости.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработан новый подход к интенсификации процесса получения пивного сусла из солода и несоложеного сырья, заключающийся в использовании на стадии затирания предварительно активированных гидролитических ферментных препаратов цитолитического и амилазного действия.

Разработаны способы активации ФП с использованием С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора ФП, приводящие к увеличению их каталитической активности в 1,7 (ФП Альфалад БН) и 3,8 (ФП Laminex BG) раза.

Применение разработанных способов предварительной активации ФП при их раздельном использовании приводит к сокращению продолжительности осахаривания затора на 30 – 45 %, увеличению выхода экстракта на 4,5 – 11 %, скорости фильтрования в 1,2 – 1,3 раза (в зависимости от качества солода).

Экспериментально обоснована возможность замены 30 % солода (для солода пониженного качества) и 40 % (для солода хорошего качества) на несоложеный ячмень при использовании МЭК на основе активированных ФП Laminex BG и Альфалад БН на стадии затирания зернопродуктов. С использованием униформ–ротатабельных планов эсперимента проведена оптимизация дозировок ФП в МЭК для сокращения продолжительности осахаривания затора и получения сусла с физико–химическими и органолептическими показателями, соответствующими стандарту, и обеспечения выхода экстракта 81 – 84 % . Показано, что проведение предварительной активации МЭК в присутствии С7-АОБ позволяет снизить в 2 раза расход ФП на затирание зернопродуктов при получении пивного сусла.

Результаты лабораторных исследований подтверждены при опытно–промышленной апробации в условиях ООО НТЦ «Солодовые напитки». Показано, что пиво из производственного сусла, полученного с использованием активированных ФП, соответствует (а по ряду показателей превосходит) требованиям ГОСТ к светлому пиву.

Разработаны принципиальная технологическая схема и технологические рекомендации по применению предварительной активации в присутствии С7-АОБ ФП Laminex BG и Альфалад БН для интенсификации технологии пивного сусла из солода и несоложеных материалов. Расчетный экономический эффект составляет 3,68 млн. руб. на 1 млн. дал пива в год.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-ей Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека», секция «Пищевая химия, биотехнология» (Кемерово, 2010); 3-ей межведомственной научно–практической конференции «Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров» (Москва, 2010); на «Инновационном форуме пищевых технологий», секция «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 – в журналах по утвержденному списку ВАК.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений. Основное содержание диссертационной работы изложено на 151 листах машинописного текста, проиллюстрировано 36 рисунками и 41 таблицами. Список литературы включает 194 источника отечественных и зарубежных авторов.

Обзор литературы.

Представлены современные представления о строении, свойствах и превращениях полисахаридов зернопродуктов при получении пивного сусла, проведен анализ опубликованных данных о роли расщепления гемицеллюлоз и гумми – веществ под действием ферментов ячменного солода и цитолитических ферментных препаратов микробного происхождения в технологии сусла и пива. Рассмотрены научные аспекты активации ферментов и применения активации промышленных ферментных препаратов для интенсификации биокаталитических процессов в пищевых технологиях. Обсуждены результаты исследований, характеризующих биологическую активность алкилоксибензолов (АОБ), и их роль в регуляции активности ферментных белков.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Объекты и методы исследования

В работе в качестве объектов исследования использовали: гидролитические ФП Laminex BG компании «Даниско» и Альфалад БН Ладыжинского завода ферментных препаратов «Энзим»; лабораторное и производственное сусло, полученное настойным способом затирания ячменных солодов различного качества (табл. 1) и смеси зернопродуктов (при частичной замене солода на ячмень).

Таблица 1

Характеристика зернопродуктов, ячменного солода, применяемых при получении пивного сусла.

Наименование показателя

Солод

(№ 1)

Солод

(№ 2)

Солод

(№ 3)

Солод

(№ 4)

Массовая доля влаги, %

4,0

4,5

5,2

4,5

Экстрактивность, %

73,4

78,2

73,2

79,5

Продолжительность осахаривания, мин

18

22

24

15

В качестве структурного модификатора ферментов, входящих в Laminex BG и Альфалад БН, был выбран С7-АОБ, относящийся к природным ауторегуляторным факторам развития микроорганизмов и растений. В работе использовали аналог природного С7-АОБ, полученный ООО «Новые технологии» РХТУ им Д.И. Менделеева совместно с институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Целлюлозолитическую активность ФП (АФБ) определяли по количеству редуцирующих веществ (РВ), образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги (ФБ), активность эндоглюканазы – вискозиметрическим методом, ксиланазную активность – по определению скорости ферментативной реакции по количеству образовавшихся РВ в результате гидролиза ксилана, амилолитическую активность (АС) – по методу Рухлядевой и Горячевой.

Кинетику действия ферментного препарата Laminex BG изучали по гидролизу некрахмальных полисахаридов модельного субстрата (ФБ). Начальную скорость ферментативной реакции (V0) в каждом варианте гидролиза определяли как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кинетическим кривым накопления РВ в начальный период реакции. Vmax и Кm определяли на основании представления зависимости Vо от [S] в координатах Лайнуивера –Берка.

Определение продолжительности осахаривания (τосах) затора зернопродуктов проводили по йодной пробе, содержание экстрактивных веществ в сусле – пикнометрическим методом, на основании чего рассчитывали выход экстракта по соответствующей формуле. Анализ пивного сусла осуществляли в соответствии с ГОСТ 29294–92 и химико–технологическим контролем производства солода и пива.

Определение содержания общего азота проводили методом Кьельдаля, аминного азота методом формольного титрования с применением смешанных индикаторов (фенолфталеина и бромтимола синего).

Для исследования фракционного состава белков и продуктов протеолиза охмеленного сусла использовали метод гель–фильтрации, основанный на разделении смеси молекул по их молекулярной массе.

РВ определяли методом Шомодьи – Нельсона и колориметрически по реакции с 3,5–динитросалициловой кислотой.

Обработку экспериментальных данных выполняли с использованием методов математической статистики. Результаты исследований в виде средних арифметических представлены на рисунках и оформлены в виде таблиц.

Проведение экспериментов по выбору оптимальных соотношений ферментов в МЭК проводили в соответствии с композиционным униформ ротатабельным планом с последующей математической обработкой с использованием метода корреляционно–регрессионного анализа и пакета программ «Matstat» и «Statistica 6,0».

2.2. Исследование условий активации ферментного препарата Laminex BG в присутствии С7-АОБ.

2.2.1. Влияние С7-АОБ на кинетику реакции гидролиза некрахмальных полисахаридов ФП Laminex BG.

На основании опубликованных в литературе данных по активации и стабилизации ферментных белков животного и растительного происхождения (лизоцина яичного белка, трипсина свиной поджелудочной железы, α и β- амилазы ячменя) природными химическими шаперенами, относящимися к классу алкилрезорцинов – алкилоксибензолов (АОБ), были проведены исследования по обоснованию выбора С7-АОБ в качестве активатора гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения.

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис. 1. Зависимость Vo=ƒ[E]: 1 – контроль;

2 – гидролиз в присутствии С7-АОБ.

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис. 2. Зависимость Vo=ƒ[S] (а); Vo=ƒ[S] в координатах Лайнуивера – Берка (б): 1 – контроль; 2 – ферментативный гидролиз в присутствии С7-АОБ.

Нами было исследо-вано влияние С7-АОБ на кинетику ферментативной реакции на примере гид-ролиза ФБ ферментным препаратом Laminex BG.

В результате прове-денных исследований бы-ли получены кинетичес-кие кривые накопления РВ в процессе ферментатив-ного гидролиза при разли-чных концентрациях фер-мента [E], субстрата [S] и С7-АОБ, определены на-чальные скорости фермен-тативной реакции V0 при различных условиях гид-ролиза и получены зави-симости V0 от концен-трации С7— АОБ, от [E] и [S] (в присутствии и в отсутствие С7-АОБ).

Анализ полученных зависимостей показал, С7— АОБ выполняет роль активатора ФП Lаminex BG: проведение гидролиза в присутствии С7-АОБ увеличивает начальную скорость реакции более, чем в 2 раза (рис. 1; 2а).

На основании представления экспериментальных данных по зависимости V0 от [S] в координатах Лайнуивера – Берка (рис. 2б), определены кинетические параметры – максимальная скорость ферментативной реакции (Vmax ) и кажущаяся константа Михаэлиса (Km). Установлено, что С7-АОБ не влияет на величину Km (Km = 0,25), но существенно увеличивает Vmax (0,0167) относительно контроля (Vmax = 0,0071). Это является косвенным подтверждением того, что С7-АОБ вызывает определенные конформационные изменения в молекуле белка фермента, следствием чего является увеличение ФА, и это позволяет интерпретировать взаимодействие С7-АОБ — фермент как неконкурентную активацию.

2.2.2. Исследование влияния тепловой обработки и С7-алкилоксибензола на активность ФП Laminex BG.

Инкубацию 1%-ого раствора ФП в ультратермостате при температуре 45 oС, 50 oС, 60 oС, 70 oС в течение 90 мин. ФА выражали в процентах к контролю (препарат без предварительной тепловой инкубации) (рис. 3.), активность которого была принята за 100 %. Концентрацию С7-АОБ варьировали в интервале 0,05 – 1,5 мг/см3. Было установлено, что проведение предикубации раствора ФП при 50 оС в течение 30 – 60 минут приводит к увеличению активности на ∼ 35 – 60% (рис. 3).

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис.3. Влияние условий предварительной тепловой обработки на активность ФП

Laminex BG.

Установлено, что во всем диапазоне изученных концентраций С7-АОБ оказывал активирующее действие на ФП. Макси-мальное увеличение ФП наблюдалось при концент-рации С7-АОБ 1 мг/см3, при длительности предин-кубации 60 мин: в 2,5 раза по сравнению с ак-тивностью ФП после тепловой обработки без С7-АОБ и в 3,8 раза – по сравнению с ФА препарата

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис. 4. Влияние длительности прединкубации на ФА Laminex BG в присутствии С7-АОБ: К-контроль;

О – опыт.

в контроле (ФП без прединкубации) (рис. 4). С учетом результатов кинетических исследо-ваний это можно объяс-нить тем, что С7-АОБ, связываясь с молекулой фермента вне активного центра, приводит к кон-формационным изме-нениям ферментного белка, увеличивающим доступность активного центра для ферментатив-ной реакции.

2.2.3. Влияние С7-АОБ на функциональную стабильность ФП Laminex BG.

Установлена стабилизирующая роль С7-АОБ при изучении термостабильности ФП (рис. 5): при прогреве растворов ФП при температурах

55 – 65 оС в течение часа (в отсутствие С7-АОБ) наблюдается существенное снижение и даже инактивация фермента; при прогреве ФП при 55 – 60 оС в при-

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис. 5. Термостабильность ФП Laminex BG:

1 – в отсутствие С7-АОБ;

2 – в присутствии С7-АОБ;

3 – максимальная активность в отсутствие С7-АОБ.

сутствии С7-АОБ ФА выше, чем в контроле, в 2,3 – 3,8 раза, а при 65 оС – на уровне контроля. Увеличение рН-стабильности ФП было продемонстрировано проявлением повышенной активности ФП при инкубации в широком диапазоне рН (3,1 – 7,0).

2.2.4. Влияние С7–АОБ на операционную стабильность ФП Laminex BG.

Для изучения влияния АОБ на оптимальные условия действия ФП Laminex BG температуру реакции гидролиза ФБ варьировали от 45 до 70 оС, а значения рН – от 3,3 до 7,0. Влияние АОБ на стабильность конформации молекул фермента оценивали по изменению рН- и температурного диапазона действия.

Анализ полученных данных показал, что операционная стабильность фермента в результате модификации его структуры С7-АОБ проявляется в значительном расширении диапазона рабочих значений рН и температуры действия ФП с сохранением оптимума катализа: даже при температуре гидролиза 70 оС ФП с С7-АОБ еще достаточно активен, его активность выше, чем в контроле более, чем в 3 раза (рис. 6). Отмечено, что во всем исследованном диапазоне рН ФА выше, чем в контроле в 2,5 – 3,0 раза.

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

Рис. 6. Влияние С7-АОБ на температурный оптимум действия препарата Laminex BG: 1 – ФП без прединкубации с С7-АОБ; 2 – ФП после прединкубации с С7-АОБ.

Таким образом, проведение прединку-бации Laminex BG в присутствии С7– АОБ позволяет не только активировать фермент, но и в значительной сте-пени расширить диапа-зон его действия как в области рН, так и тем-пературы, что будет спо-собствовать более эффективному исполь-зованию ферментного препарата при получе-нии пивного сусла.

2.3. Разработка условий применения предварительной активации ФП Laminex BG при затирании зернопродуктов в процессе получения пивного сусла.

Исследования проводили путем проведения лабораторного затирания настойным способом. В качестве примера в табл. 2 представлены результаты исследований при использовании солода № 1.

Таблица 2

Выбор дозировки С7-АОБ для применения активации ФП Laminex BG при получении пивного сусла (солод №1)

п/п

Вариант

опыта

Продолжительность

осахаривания затора

Выход экстракта

Скорость фильтрования

мин

% к контролю

%

% к контролю

см3

% к контролю

1

Контроль – 1 (без ФП)

18

100

73,7

100

0,25

100

2

Контроль –2 (ФП без активации)

14

77,7

75,2

102

0,27

108

3

Концентрация С7-АОБ при прединкубации ФП, % к солоду

0,01

14

77,7

75,8

102,8

0,27

108

0,02

12

66,7

76,4

103,6

0,28

112

0,06

10

55,6

77,3

104,8

0,33

132

0,10

10

55,6

80,0

108,5

0,33

132

На основании проведенных исследований определены следующие условия применения ФП Laminex BG для интенсификации гидролитических процессов при получении пивного сусла: концентрация ФП – 0,3% к массе солода; условия прединкубации раствора ФП: tо = 50 оС; длительность прединкубации – 1 час; концентрация С7-АОБ – 0,1 % к массе солода.

Продолжительность осахаривания при этом сокращается на 45 %, выход экстракта увеличивается на 8,5 %, скорость фильтрования увеличивается более, чем на 30 %.

Полученные результаты были подтверждены при использовании других солодов, отличающихся большей продолжительностью осахаривания затора (солод № 2 и № 3) (табл. 3).

Однако при замене 30 % солода на ячмень такой показатель, как выход экстракта (ВЭ) существенно ухудшался. Это указывает на то, что активация ФП Laminex BG не может компенсировать полностью уменьшение количества солодовых ферментов.



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст