Совершенствование вирусологических исследований водных объектов

На правах рукописи

Зыкова Татьяна Алексеевна

Совершенствование вирусологических исследований водных объектов окружающей среды в системе

санитарно-вирусологического надзора

03.00.06 – вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2006

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области»

Научные руководители:

кандидат медицинских наук

Иванова Ольга Евгеньевна

доктор медицинских наук,

профессор

Айдинов Геннадий Тртадович

Официальные оппоненты

кандидат медицинских наук

Недачин Александр Евгеньевич

доктор медицинских наук

Королева Галина Александровна

Ведущая организация:

ФГУН «Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора

Защита состоится ____2 июня________ 2006 года в ____10.00________

часов на заседании диссертационного совета Д.001.026.01 при ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу:

142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан__________27 апреля______ 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Медведкина О.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекционные заболевания продолжают оставаться одной из основных причин болезни и смерти в большинстве стран Европы, в том числе и в России. Только в 2003г в России было зарегистрировано более 32 миллионов случаев инфекционных заболеваний, экономический ущерб от которых составил 27375,7 миллиона рублей (Г.Г. Онищенко, 2004).

Крайнюю актуальность для практического здравоохранения России сохраняет проблема кишечных инфекций, прежде всего вирусного гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита и энтеровирусных инфекций. По данным Г.Г. Онищенко (2004) удельный вес острого гепатита А в общей структуре вирусных гепатитов в 2003г составил 58,4%. Высокий уровень заболеваемости гепатитом А наблюдали в регионах, имеющих серьезные проблемы с обеспечением доброкачественной питьевой водой. Антиген вируса гепатита А в РФ в 2003г был обнаружен в 14,7% проб источников децентрализованного водоснабжения и в 6,6% проб воды водоемов первой категории. В России в последние годы отмечается рост числа водных вспышек вирусного гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита и энтеровирусных инфекций (Г.Г. Онищенко, 2002).

Традиционные системы водоподготовки, применяемые в нашей стране, не обеспечивают полного освобождения природной воды от вирусов, что обуславливает актуальность исследований в области совершенствования технологии систем очистки природных вод (В.И. Терентьев и др., 2002).

В этих условиях регулярный контроль и адекватная оценка качества воды источников водоснабжения и питьевой воды в отношении их вирусного загрязнения приобретает особое значение.

Проблема санитарно-вирусологического контроля водных объектов становится особенно актуальной в последние годы в связи с увеличением антропогенной и техногенной нагрузки на объекты окружающей среды, ненормируемым сбросом неочищенных или недостаточно очищенных сточных вод в поверхностные водоемы, используемые как источники хозяйственно-питьевого водоснабжения, неудовлетворительным санитарно-техническим состоянием водопроводных коммуникаций.

Действующие в настоящее время нормативно-методические документы, регламентирующие контроль над объектами хозяйственно-питьевого водоснабжения, не всегда обеспечивают эффективный текущий и предупредительный надзор и, как следствие, не всегда позволяют получить объективную и своевременную оценку сложившейся эпидемической ситуации.

В соответствии с СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству виды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества» исследования питьевой воды на энтеровирусы проводятся лишь при повторном получении результатов, не соответствующих нормативу, а также по эпидпоказаниям. Обнаружение вируса гепатита А и ротавируса с использованием современных иммунохимических и молекулярно-биологических методов существующими документами не регламентируется.

Контроль за безопасностью питьевой воды с использованием традиционных бактериальных индикаторов и косвенных показателей (колифагов) не всегда надежен и зачастую приводит к неверной оценке ее безопасности в отношении вирусного загрязнения (Т.В. Амвросьева и соавт., 2002; Г.П. Кашкарова и соавт., 2002, 2004; В.В. Малышев и соавт., 2004).

Объемы вирусологических исследований питьевой воды в РФ ограничены, кроме того, проводятся они эпизодически и только на отдельных территориях. Практически отсутствуют сведения о многолетней и внутригодовой динамике вирусной контаминации питьевой и речной воды, что препятствует пониманию механизма влияния водного фактора на эпидемический процесс кишечных вирусных инфекций.

Выработка наиболее эффективной тактики проведения санитарно-вирусологических исследований в условиях современной эпидемической ситуации невозможна без изучения уровня вирусной контаминации водных объектов.

Результативность вирусологического контроля за водными объектами напрямую зависит от выбора показателей качества воды в отношении ее вирусного загрязнения, методов исследований и оценки их результатов. В то же время единых подходов к методикам отбора проб и методологии лабораторных исследований нет.

Все вышеперечисленное диктует необходимость разработки системы вирусологического надзора за водными объектами окружающей среды.

Основной целью настоящего исследования является научное обоснование комплекса наиболее эффективных методов проведения санитарно-вирусологического контроля водных объектов окружающей среды (на материале Ростовской области).

Исходя из поставленной цели, были определены и основные задачи:

1. Установить уровень и структуру вирусного загрязнения водных объектов Ростовской области.

2. Оценить роль водного фактора в распространении кишечных вирусных инфекций на территории Ростовской области.

3. Обосновать необходимость проведения прямых вирусологических исследований речной и питьевой воды.

4. Оценить эффективность традиционных методов водоподготовки по освобождению от вирусной контаминации.

5. Обосновать методические приемы санитарно-вирусологических исследований проб воды разной степени биологического загрязнения (сточной, речной, питьевой).

Научная новизна:

В результате многолетних наблюдений впервые были установлены особенности циркуляции кишечных вирусов в водных объектах Ростовской области, определены цикличность, сезонность и типовой состав циркулирующих вирусов.

Впервые проведена оценка барьерной роли действующих водоочистных сооружений Ростовской области в отношении вирусного загрязнения природной воды в местах водозаборов.

Расширено представление о роли водного фактора в распространении кишечных вирусных инфекций. Впервые выявлена статистическая зависимость между уровнем вирусного загрязнения объектов водоснабжения и уровнем заболеваемости населения Ростовской области вирусным гепатитом А и ротавирусным гастроэнтеритом.

По результатам работы научно обоснована необходимость оптимизации методов исследований и предложена система вирусологического контроля за водными объектами окружающей среды.

Показана целесообразность проведения прямых вирусологических исследований воды с использованием иммунохимических методов определения антигенов вируса гепатита А и ротавируса, наряду с выделением энтеровирусов в культуре клеток.

Практическая значимость:

В результате проведенных исследований была усовершенствована система контроля качества воды разного вида пользования в отношении ее вирусного загрязнения в Ростовской области.

Результаты исследований были использованы при подготовке нормативных и методических документов:

• методических рекомендаций «Профилактика ротавирусной инфекции», утв. 25.12.2001, № МР 04-1-16/2636; «Метод концентрирования кишечных вирусов в пробах сточной воды с помощью модифицированного метода марлевого тампона» № 04-3-16/458 от 18.05.2005г;

• регионального плана действий по гигиене окружающей среды Ростовской области на 2002-2005гг. (РПДГОС), утвержденного заместителем Главы Администрации (Губернатора) Ростовской области 16.08.2002г и региональной целевой программы «Обеспечение населения Ростовской области питьевой водой»;

• обзора «Ликвидация полиомиелита в Ростовской области. Прошлое, настоящее, будущее». Под редакцией д.м.н., профессора Айдинова Г.Т., д.м. н., профессора Кондратенко Т.А. – Ростов-на-Дону. – 2004;

• информационных писем по проведению санитарно-вирусологических исследований в Ростовской области (№ 04-5/447 от 05.06.1995, № 04-5/753 от 27.04.1999, № 04-3-16/3521 от 28.10.2002);

• ежегодных информационных сборников статистических и аналитических материалов «Анализ деятельности микробиологических лабораторий центров госсанэпиднадзора в Ростовской области по ведомственной отчетности ф. № 6-96 (вирусологические исследования)», приказов ЦГСЭН в Ростовской области, государственных докладов о санитарно-эпидемиологической обстановке в Ростовской области и мерах по ее стабилизации.

Материалы диссертационной работы были использованы при чтении лекций на курсе повышения квалификации в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (выездной цикл).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Высокий уровень вирусной контаминации водных объектов Ростовской области существенно влияет на состояние заболеваемости населения кишечными вирусными инфекциями.

2. Существующие системы водоподготовки природной воды не позволяют полностью исключить вирусное загрязнение питьевой воды.

3. Контроль за вирусной контаминацией водных объектов должен осуществляться с обязательным использованием прямых вирусологических исследований.

4. Экспресс-методы исследований, в том числе определение антигенов вируса гепатита А и ротавируса в ИФА, могут быть использованы в системе санитарно-вирусологического надзора за объектами водоснабжения.

Результаты исследований доложены и обсуждены:

• на 7 съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997г;

• на региональных совещаниях врачей эпидемиологов и вирусологов центров госсанэпиднадзора субъектов Южного федерального округа «Эпидемиологический надзор за полиомиелитом и острыми вялыми параличами. Безопасное лабораторное хранение диких полиовирусов» (Ставрополь, октябрь 2002г, Ставрополь, октябрь 2003г);

• на Всероссийской научно-практической конференции «Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск», Санкт-Петербург, 20-21 ноября 2003г;

• на 6-м Международном конгрессе «Вода: экология и технология. Экватэк-2004», Москва, 1-4 июня 2004г;

• на областных совещаниях эпидемиологов и инфекционистов по профилактике ОВП и полиомиелита (Волгодонск, 2003г; Таганрог, 2004г);

• на областном и городском совещаниях эпидемиологов и инфекционистов по профилактике ОКИ и энтеровирусных инфекций (Ростов-на-Дону, 2004г);

• на заседании Ростовского отделения Всесоюзного научного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ростов-на-Дону, 2005г).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного ученого совета ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН 26 января 2006г.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 25 печатных работ в отечественных научных журналах и сборниках научных трудов, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, библиографического указателя. Работа содержит 47 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 172 источника, в том числе 120 отечественных и 52 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Выделение и идентификацию энтеровирусов, определение антигенов вируса гепатита А (АГ ВГА) и ротавируса в пробах воды выполняли в вирусологической лаборатории, а исследования проб воды на колифаги – в бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области». Верификацию и внутритиповую дифференциацию выделенных штаммов полиовирусов проводили в лаборатории вирусологии окружающей среды ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва). Частичное секвенирование генома полиовирусов проводили в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (г. Москва). Период исследований – 1992-2003гг. Объекты, виды и объем исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Объекты, виды и объем исследований

Направления исследований

Объекты исследований

Виды исследований

Объем исследований

Вирусологические исследования объектов окружающей среды

1. Питьевая вода

2. Вода

поверхностных источников водоснабжения

3. Вода подземных

источников водоснабжения

4. Речная вода из зон рекреаций

5. Сточная вода

6. Клинический

материал

7. Изоляты

полиовирусов

Выделение энтеровирусов

Обнаружение АГ ВГА

Обнаружение АГ ротавируса

Обнаружение колифагов

Выделение энтеровирусов

Обнаружение АГ ВГА

Обнаружение АГ ротавируса

Обнаружение колифагов

Выделение энтеровирусов

Обнаружение АГ ВГА

Обнаружение АГ ротавируса

Выделение энтеровирусов

Обнаружение АГ ВГА

Обнаружение колифагов

Выделение энтеровирусов

Выделение энтеровирусов

Внутритиповая дифференциация штаммов полиовирусов

2355 проб

2355 проб

2355 проб

150 проб

872 пробы

872 пробы

872 пробы

62 пробы

402 пробы

402 пробы

402 пробы

477 проб

477 проб

110 проб

2461 проба

1506 проб

73 штамма

Ретроспективный анализ многолетней и вспышечной заболеваемости гепатитом А и ротавирусным гастроэнтеритом проводили с использованием форм Федерального статистического наблюдения «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» ф.№1 (месяц) и ф. №2 (годовая) и Форма № 23 – санэпид ОАСУ – ВСПЫШКА «Донесения о вспышках кишечных инфекций».

Использовали понятия «суммарное вирусное загрязнение» и «число проб с вирусным загрязнением», которые подразумевают число проб с одним или несколькими маркерами вирусного загрязнения (энтеровирусы, антиген вируса гепатита А, антиген ротавируса).

Концентрирование вирусов из проб сточной воды проводили с помощью:

– метода марлевого тампона по В. Moore (1948). Концентрирование вирусов проводили по методу J. Riordan (1962) в традиционной постановке и в собственной модификации. В метод J. Riordan был внесен ряд изменений: для элюции вирусов с тампона использовался 0,05М глициновый буфер рН 11,5 с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота; время контакта элюирующего раствора с тампоном было увеличено до 18-24 часов при t=+40С+80С; исключен этап предварительного замораживания элюата перед заражением культуры клеток.

– адсорбционного метода с использованием макропористого стекла (МПС), в соответствии с методическими рекомендациями «Метод сбора и концентрирования кишечных вирусов с помощью водопроницаемых пакетов с адсорбентом» № 11-3/191-04 от 04.07.2000.

Концентрирование вирусов в пробах речной и питьевой воды проводили в соответствии с методическими рекомендациями по изучению роли водного фактора в заболеваемости населения вирусным гепатитом А (№28-6/17 от 20.05.1986), «Методическими рекомендациями по организации и проведению эпидемиологического и санитарно-вирусологического надзора за качеством воды водоисточников, питьевой воды в системе водоснабжения с целью профилактики заболеваемости гепатитом А и другими кишечными вирусными инфекциями» № 01-19/12-13 от 11.09.1992, методическими рекомендациями «Ротавирусная инфекция» №15-6/6 от 07.03.1989, методическими рекомендациями «Метод сбора и концентрирования кишечных вирусов с помощью водопроницаемых пакетов с адсорбентом» №11-3/191-04 от 04.07.2000.

Выделение и идентификацию энтеровирусов проводили в соответствии с Руководством по вирусологическим исследованиям полиомиелита (ВОЗ, 1998). Для выделения энтеровирусов использовали культуры клеток RD, Hep-2 и L20В. Для идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации использовали сыворотки диагностические энтеровирусные сухие, изготовленные ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН».

Повторное типирование и внутритиповую дифференциацию полиовирусов в ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН осуществляли с помощью стандартных процедур, рекомендованных ВОЗ (Manual for virological investigation of poliomyelitis, WHO, 1997) в тесте микронейтрализации с кроличьими антисыворотками к вирусам полиомиелита (RIVM, Bilthoven, the Netherlands). Внутритиповую дифференциацию проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с перекрестно-адсорбированными поликлональными кроличьими антисыворотками (RIVM, Bilthoven the Netherlands) и с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, специфичными к вакцинным штаммам Sabin.

Определение антигенов ВГА и ротавируса проводили методом твердофазного ИФА с использованием коммерческих тест-систем производства НПО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск), ЗАО «Биоиммуноген» (г. Москва).

Определение содержания колифагов проводили методом агаровых слоев в соответствии с «Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов» № 2285-81 от 19.01.1981 и титрационным методом в соответствии с МУК «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды» № 4.2.1018-01.

Полевые исследования:

1. Сравнение эффективности концентрирования энтеровирусов из проб сточной воды с использованием метода марлевого тампона в собственной модификации и метода МПС.

Пакет с МПС и марлевый тампон одновременно помещали в ток сточной воды в одну и ту же точку на семь суток. После завершения экспозиции марлевый тампон и пакет с МПС одновременно извлекали из тока сточной воды, и доставляли в вирусологическую лабораторию с соблюдением условий холодовой цепи. Концентратами проб заражали три клеточные культуры (RD, L20B, HEP-2) одновременно.

2. Изучение эффективности очистки природной воды от вирусной контаминации в условиях действующих водоочистных сооружений.

Отбор проб для вирусологических исследований проводили одномоментно в двух точках: на входе и на выходе очистных сооружений водопровода. Исследования на очистных сооружениях ОАО «Исток» г. Каменск-Шахтинского проводили в период с ноября 2000г по август 2002г. Пробы воды отбирали один раз в две недели в объеме 10,0 л. Концентрирование вирусов в пробах воды проводили двухэтапным методом с использованием ионообменной смолы АВ 17-8 и гидроокиси алюминия с последующим осаждением сульфатом аммония. На Азовских водоочистных сооружениях для концентрирования вирусов использовали метод МПС. Пакеты помещали в ток воды до и после очистки одномоментно. После трех-четырех дневной экспозиции пакеты извлекали из воды, одномоментно в ток воды устанавливали новые пакеты с МПС. Таким образом, последовательно меняя пакеты, удалось пропустить через МПС весь объем воды, поступавшей на очистные сооружения и выходящей после очистки в течение всего периода наблюдения. Исследования проводили с января 2002г по декабрь 2002г включительно.

3. Оценка информативности колифагов в отношении вирусного загрязнения воды.

Отбор проб для исследования на колифаги, энтеровируса и антигены вирусов гепатита А и ротавируса проводили одновременно.

При анализе результатов исследований применяли методы математической статистики: вычисление интенсивных и экстенсивных показателей; оценку достоверности показателей определяли по величине ошибки репрезентативности, оценку достоверности разницы двух показателей – с помощью доверительного коэффициента Стьюдента. Установление причинно-следственных связей между инфекционной заболеваемостью и уровнем вирусного загрязнения воды проводили с использованием коэффициента корреляции. Все вычисления проводили с использованием пакета прикладных программ Exсel.

Заболеваемость кишечными вирусными инфекциями. Ростовская область относится к регионам средней эндемичности по вирусному гепатиту А (С.Л. Мукомолов и др., 2000). Несмотря на то, что заболеваемость гепатитом А в Ростовской области в период с 1992г по 2003г имела четко выраженную тенденцию к снижению, удельный вес вспышечной и групповой заболеваемости оставался стабильным и составлял 2,5-5,0% от общего числа зарегистрированных случаев. При этом ведущая роль в ухудшении эпидемической ситуации и возникновении вспышек среди населения принадлежала водному пути передачи вируса гепатита А. Из общего числа официально зарегистрированных вспышек гепатита А, 61,4% были водными.

В отношении ротавирусного гастроэнтерита в Ростовской области проявилась отчетливо выраженная тенденция к росту заболеваемости.

Проведенный анализ позволяет утверждать, что энтеровирусные инфекции – актуальная для Ростовской области проблема. При обследовании больных с диагнозами серозный менингит, острая кишечная инфекция, острый вялый паралич неполиомиелитные энтеровирусы (НПЭВ) были выделены от 7,2% заболевших. Чаще всего НПЭВ были изолированы от детей в возрасте 0-2 года (29,8%) и 11-14 лет (22,8%).

В результате исследований было показано, что интенсивность циркуляции неполиоэнтеровирусов среди больных и во внешней среде совпадала. Была установлена летне-осенняя сезонность циркуляции неполиомиелитных энтеровирусов в сточной воде и среди больных, однако в сточной воде период сезонной циркуляции был более длительным (с августа по ноябрь), чем у больных (с августа по сентябрь). При отсутствии официальной регистрации энтеровирусных инфекций исследования сточной воды позволяли получать объективную информацию о циркуляции энтеровирусов среди населения.

Оптимизация методов лабораторного контроля водных объектов. Сравнивали эффективность методов концентрирования вирусов: метода J. Riordan в традиционной постановке, в собственной модификации и метода макропористого стекла (МПС) для сточной воды; бентонита, ионообменной смолы и МПС для питьевой воды.

При использовании метода отбора проб сточной воды с помощью марлевого тампона и элюции вирусов по методу J. Riordan цитопатогенные объекты (ЦПА) удалось обнаружить в 8,2+1,2% проб. При использовании метода элюции вирусов в собственной модификации ЦПА были обнаружены в 15,6+0,9% проб сточной воды.

Метод отбора проб сточной воды с помощью марлевого тампона и элюцией вирусов в собственной модификации по эффективности в 2,1 раза превышал метод J.Riordan. Разница показателей была статистически достоверна (t=5,4; p<0,001) (таблица 2).

Таблица 2

Частота выделения энтеровирусов из проб сточной воды при отборе методом марлевого тампона

Метод элюции вирусов

Число исследованных проб

Число проб с ЦПА

Число проб с ПВ

Число проб с НПЭВ

абс

%+m

абс

%+m

абс

%+m

метод J. Riordan

514

37

7,2+1,1

13

2,5+0,7

24

4,7+0,9

модифицированный

1422

213

15,0+0,9

58

4,1+0,5

155

10,9+0,8

Было установлено, что наиболее эффективным из доступных методов концентрирования вирусов из сточной воды оказался метод МПС.

При параллельных исследованиях с помощью метода марлевого тампона в собственной модификации удалось выделить ЦПА из 12,4+3,2%, а при использовании МПС – из 24,8+4,2% проб сточной воды. Таким образом, было показано, что использование метода МПС по эффективности в 2,0 раза превышало модифицированный метод марлевого тампона. Разница показателей была статистически достоверна (t=2,3; p<0,05) (таблица 3).

Серологическое разнообразие штаммов, выделенных с помощью метода МПС, оказалось больше.

Таблица 3

Эффективность концентрирования вирусов в пробах сточной воды с помощью метода марлевого тампона в собственной модификации и метода МПС

Метод концентрирования

Число исследованных проб

Число проб с ЦПА

Число проб с ПВ

Число проб с НПЭВ



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст