Свободнорадикальные процессы в крови крыс при умеренной гипотерм

Федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

ОМАРОВА ЛЕЙЛА ТАДЖИБОВНА

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ

В КРОВИ КРЫС ПРИ УМЕРЕННОЙ ГИПОТЕРМИИ

И ВВЕДЕНИИ ДАЛАРГИНА

03.01.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена на кафедре химии Дагестанского государственного

технического университета и кафедре биохимии и биофизики

Дагестанского государственного университета.

Научный руководитель:доктор биологических наук, профессор

Кличханов Нисред Кадирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чиков Владимир Иванович (ФГБУН «Ка-занский институт биохимии и биофизики» Каз НЦ РАН, зав. лабораторией)

кандидат биололгических наук, Ганеева Лилия Ахатовна (лаборатория биохимии нуклеиновых кислот института фундамен-дальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федераль-ный университет, научный сотрудник.)

Ведущая организация:Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится 31 октября 2013 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория № 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «______»_______________ 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженной реакционной способностью. АФК образуются в результате нормально протекающих процессов в организме и выполняют определенную биологическую функцию. Действие АФК в организме фактически направлено на 3 типа клеточных мишеней: белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В норме они активно участвуют в их метаболизме, а при патологических состояниях – в их окислительной деструкции (Меньщикова и др., Окислительный стресс: Прооксиданты и антиоксиданты. – М.: Фирма «Слово». 2006. 554 с.; Magder. Critical Care. 2006. V. 10, N. 1. P. 208-216.).

В настоящее время общую и локальную гипотермию используют в медицинской практике, главным образом, в целях снижения кислородных запросов тканей и устранения ишемических и гипоксических явлений (Polderman, Crit. care Med. 2009. V. 37(7). P. S186-S202.). В то же время для ненаркотизированных животных гипотермия представляет определенную опасность, связанную с активацией свободнорадикальных процессов (СРП) в тканях (Дорохина, Зинчук, Bесцi НАН РБ. Сер. бiял. нав. 2000. № 4. С. 87–90; Кличханов и др. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. Т.131, № 3. С. 281-284.; Erecinska et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003. V. 23. P.513-550; Ахалая и др., Бюл. эксперим. биол. и мед. 2006. Т. 141, № 1. С. 31-34.). Свободнорадикальный гомеостаз клеток и тканей обеспечивается согласованием между ферментативными и неферментативными системами генерации АФК с одной стороны, и системами их элиминации – с другой. Гипотермия может смещать баланс в сторону избыточной генерации свободных радикалов и приводить к дефициту антиоксидантов (Zinchuk et al. J. Thermal Biology. 2002. V. 27. P. 345-352), что, в свою очередь, окажет существенное влияние на химический состав биологических мембран, их ультраструктурную организацию, проницаемость, активность мембранных ферментов. В связи с этим вопрос о возможности регуляторного влияния на СРП в тканях при гипотермических состояниях остается актуальным.

Антистрессорные вещества понижают интенсивность СРП и оказывают протекторное действие на мембраны. К таким веществам относится ряд пептидов, в частности синтетический гексапептид даларгин. Даларгин (Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг) – синтетический аналог нейропептида лей-энкефалина, содержащий ключевую последовательность аминокислот всех опиоидов (Тир-Гли-Гли-Фен) (Лишманов, Маслов. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. 352 с.). Показано, что предварительное внутрибрюшинное введение даларгина снижает степень активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в миокарде крыс при ишемии и стрессовых воздействиях, а также в печени при холестазе (Лишманов и др. Успехи физиол. наук. 1997. Т. 28, № 1. С. 75-96; Реброва и др. Биомедицинская химия .2005. Т. 51. С. 177-184). Внутривенно введенный даларгин (100 мкг/кг) предотвращал стимулируемую оксидантами (Fe2+-аскорбат) активацию процессов ПОЛ в изолированном сердце (Лишманов и др. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1992. Т. 64, № 11. С. 468-470). Использование даларгина в комплексе общей анестезии ограничивало активацию ПОЛ в крови в реперфузионном периоде после аортокоронарного шунтирования (Князькова и др. Патология кровообращения и кардиохирургия. – 2007. № 4. С. 21-26.). Предварительное введение даларгина (100 мкг/кг) предотвращало активацию ПОЛ в крови и нарушение структурно-функциональных свойств эритроцитов при гипотермии (Эмирбеков и др., Изв. вузов Сев.-Кав. рег. Естеств. науки. Спецвыпуск. 2005. С. 63-66.). Таким образом, при стрессорных и патологических состояниях введение даларгина предотвращает активацию СРП в тканях. Однако механизмы антиоксидантного действия даларгина пока еще полностью не установлены.

Цель исследования изучить пути активации свободнорадикальных процессов в крови крыс при острой кратковременной умеренной гипотермии, а также механизмы их коррекции даларгином.

Задачи исследования:

1. Определить уровень гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочеч-никовой и тиреоидной систем в крови в условиях раздельного и сочетанного применения гипотермии и даларгина.

2. Провести сравнительный анализ интенсивности процессов ПОЛ в различных тканях до и после введения даларгина.

3. Изучить изменение уровня мочевой кислоты и метаболитов оксида азота в плазме крови при гипотермии на фоне введения даларгина.

4. Выявить действие даларгина на интенсивность окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов при умеренной гипотермии.

5. Оценить уровень прооксидантов и активность компонентов антиоксидантной защиты плазмы крови и эритроцитов при гипотермии и введении даларгина.

6. Показать степень перекисного, кислотного и внутрисосудистого гемолиза эритроцитов при гипотермии до и после введения даларгина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Умеренная гипотермия сопровождается развитием холодового стресса, что приводит к стимуляции процессов образование АФК, окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов. Окислительные повреждения мембран эритроцитов при гипотермии приводят к их гемолизу.

2. Введение животным перед охлаждением даларгина предупреждает развитие холодового стресса, снижает стимулирующее действие гипотермии на интенсивность свободнорадикальных процессов в крови, защищает эритроциты от окислительного повреждения.

Научная новизна. Показано, что умеренная гипотермия приводит к гиперстимуляции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. Впервые установлено, что умеренная гипотермия стимулирует образование активных форм кислорода, повышение уровня прооксидантов в плазме, снижение содержания восстановленного глутатиона (GSH) в эритроцитах, что способствует развитию окислительного стресса в крови. Окислительные повреждения белков и липидов мембран эритроцитов при гипотермии приводят к ускорению внутрисосудистого гемолиза эритроцитов.

Установлено, что даларгин снижает интенсивность ПОЛ в различных тканях и этот эффект зависит от времени внутрибрюшинного введения пептида. Впервые установлено, что при низких концентрациях (100 мкг/кг.) даларгин не проявляет непосредственное антиоксидантное действие. Впервые показано, что введение даларгина предотвращает развитие холодового стресса у крыс при умеренной гипотермии. Даларгин в условиях гипотермии предотвращает рост уровня АФК в крови, степень окислительной модификации липидов и белков плазмы крови и мембран эритроцитов, падение уровня GSH в эритроцитах. Впервые показано, что даларгин предотвращает повышение уровня прооксидантов в крови при гипотермии. Защита мембран от окислительного повреждения даларгином предотвращает внутрисосудистый гемолиз эритроцитов при гипотермии.

Теоретическая и практическая значимость. Обнаруженные в работе закономерности развития свободнорадикальных процессов при умеренной гипотермии могут быть использованы для построения моделей взаимосвязи между интенсивностью энергетического обмена и генерацией свободных радикалов, а также для построения теории эволюции адаптивных механизмов, контролирующих СРП в клетках. Решение указанных теоретических проблем позволит разработать меры по предотвращению вспышек СРП при существенных изменениях интенсивности метаболических процессов в организме.

Результаты исследования расширяют представления о клеточных механизмах регуляции лигандами опиоидных рецепторов СРП. Полученные в данной работе факты, раскрывающие механизмы реализации антистрессорного, «антиоксидантного» и мембранностабилизирующего свойств даларгина (выпускаемого рядом фармацевтических фирм в качестве лекарственного препарата) в условиях гипотермии, открывают новые перспективы его практического применения в медицине с целью управления адаптационными реакциями организма.

Внедрение результатов работы в практику. Основные результаты работы внедрены в учебный процесс в виде методических разработок для проведения практических и семинарских занятий на кафедре биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета и включены в спецкурс «Свободнорадикальные процессы в биологических системах».

Апробация работы. Результаты настоящего исследования были представлены и обсуждены на II Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2008), XXIX и XXX итоговых научно-технических конференциях преподавателей, сотрудников, аспирантов и студентов ДГТУ (Махачкала, 2008, 2009), 12-й, 14-й Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2008, 2010), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных» (г. Махачкала, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), на расширенном заседании кафедры технологии приготовления пищи ДГТУ и кафедры биохимии и биофизики ДГУ (2012). По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы (239 источника). Диссертационная работа содержит 3 рисунка и 17 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 226 крысах-самцах линии Вистар, массой 200-220 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Эксперимент проводился в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, регламентирующих выполнение исследований по безопасности и эффективности фармакологических веществ в Р Ф (Приказ МЗ РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» № 267 от 19.06.2003 г.) и международных правил правовых и этических норм использования животных.

Гипотермию вызывали наружным охлаждением животных в плексигласовых камерах. Температуру тела равномерно снижали от 38 до 30 ° С за 28-30 мин.

Фармакопейный препарат даларгин (НПО «Микроген») вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг. массы тела за 30 мин. до декапитации (контроль) или за 30 мин.до начала снижения температуры тела крыс. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора. Дозы и сроки инъекции даларгина подобраны, основываясь на биохимических и физиологических эффектах пептида (Лишманов, Маслов, Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. 352 с.).

Из головного мозга, печени, миокарда и скелетных мышц готовили 10% гомогенаты в 0,1 М трис-HCl буфере рН 7,4. Гомогенаты тканей центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Постядерные гомогенаты использовали в опыты. Тени эритроцитов получали после гипоосмотического гемолиза (Казенов и др., Биохимия. 1984. Т. 49, № 7. С. 1089-1095.).

Исследование содержания адренокортикотропного гормона (АКТГ), кортизола, тироксина в плазме крови проводилось радиоиммунологическим методом с использованием стандартных тест-наборов фирмы «Immunothech» (США) на гамма-счетчике «Микро-800» (США).

Интенсивность образования АФК оценивали по содержанию мочевой кислоты и оксида азота в плазме крови. Содержание мочевой кислоты в плазме крови определяли энзиматическим методом «Ольвекс Диагностикум». Уровень продукции оксида азота оценивали по содержанию его стабильных конечных метаболитов – нитратов и нитритов в плазме крови. Предварительно нитраты восстанавливали металлическим кадмием до нитритов, концентрации которых определяли по цветной реакции с реактивом Грисса (Емченко и др. Клин. лаб. диагностика. 1994. №6. С.19-20.).

Об интенсивности ПОЛ в крови судили по содержанию первичных (диеновых конъюгатов, ДК) и вторичных (малоновый диальдегид, МДА) продуктов пероксидации липидов. Содержание ДК в гептановых и изопропанольных экстрактах крови определяли по поглощению в ультрафиолетовой области спектра (Волчегорский и др. Вопр. мед. хим. 1994 . № 2. С. 28-32.). Количественное определение МДА в плазме крови и эритроцитах проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Интенсивность ПОЛ в гомогенатах тканей оценивали по содержанию МДА (Лемешко и др. Укр. биохим. журн. – 1987. Т. 59. С. 50-57.). При этом измерено исходное содержание МДА и его накопление в гомогенатах тканей за 30 минут в присутствии системы Fe2+-аскорбат.

Об интенсивности окислительной модификации белков (ОМБ) плазмы крови и мембран эритроцитов судили по содержанию в них карбонильных групп, реагирующих с 2,4-динитрофенолгидразином (Дубинина и др., Жизнь и смерть, созидание и разрушение. С.-Петербург, 2006. 400 с.). Содержание тиоловых групп в белках плазмы крови и мембран эритроцитов определяли методом амперометрического титрования (Соколовский.Лаб. дело. 1962. № 8. С. 3-6.), а дисульфидных связей – методом обратного титрования (Соколовский и др. Лаб. дело. 1977. № 1. С. 26-28.). Содержание среднемолекулярных пептидов (СМП) в плазме крови определяли по методу В.С. Осиповича и З.А. Тупиковой (1987). Общее содержание железа в сыворотке крови крыс определяли на биохимическом анализаторе «Ультра 906» фирмы «Коне» (Финляндия), с использованием тест-набора фирмы «Коне».

Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах определяли методом Эллмана (Арутюнян и др. Методические рекомендации. СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. 104 с.). Об антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови судили по кинетике окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола кислородом (Семёнов, Ярош. Укр. биохим. журн. 1985. Т. 57, № 3. С. 50-52.). Активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы определяли в гемолизатах. Об активности СОД судили по ее способности ингибировать процесс восстановления тетразолиевого нитросинего и феназинметасульфата в условиях генерации супероксидного анион-радикала (Дубинина и др. Укр. биохим. журн. 1988. Т. 60, № 3. С. 20-24.). Об активности каталазы судили по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации (Королюк и др. Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.). Содержание гемоглобина определяли аммиачным методом (Лопатина и др. Лаб. дело. 1976. № 6. С. 328-331.). Содержание белка в плазме крови определяли биуретовым методом (Скоупс.Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. 358 с.), а в мембранах эритроцитов – методом Лоури (Lowry et al..J. Biol. Chem. 1951. V. 193(1). P. 265-275.).

Перекисную резистентность эритроцитов определяли по методу Ю.А. Юркова (1984). Определение кислотной резистентности эритроцитов проводили с использованием 0,004 н. HCl в качестве гемолитика (Леонова. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. – Новосибирск: Наука, 1987. 242 с.). Интенсивность внутрисосудистого гемолиза оценивали по содержанию свободного гемоглобина в плазме крови (Турбина и др. Лаб. дело. 1970. № 2. С. 259-265.).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакетов прикладных программ Statistica-6.0 (Windows XP) и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. На гистограммах и в таблицах результаты представлены в виде средних значений (М) ± стандартная ошибка (m). Достоверность различий средних величин оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при значениях р<0,05. Между анализируемыми показателями также устанавливалась корреляционная взаимосвязь с использованием многофакторного регрессионного анализа (Юнкеров, Григорьев, Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние даларгина на содержание

стрессорных гормонов в плазме крови при гипотермии

Результаты исследования содержания гормонов в плазме крови приведены в табл. 1. Умеренная гипотермия достоверно увеличивает содержание АКТГ в плазме крови на 22,9% относительно контроля. Полученные нами данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии АКТГ на функции надпочечников в условиях низкой температуры тела, поскольку содержание кортизола в сыворотке крови повышается на 68,6%. Стимуляция секреции АКТГ и соответственно кортизола, обеспечивает адаптацию организма к стрессорному воздействию холода на организм.

При острой гипотермии содержание тироксина в сыворотке крови, в отличие от АКТГ и кортизола, снижается на 33,5% (табл. 1). Такое снижение содержания тироксина в сыворотке крови могло быть связано либо со снижением его секреции из щитовидной железы, либо с усиленным поступлением гормона в ткани.

Таблица 1

Содержание адренокортикотропного гормона, кортизола и тироксина в сыворотке крови крыс при умеренной гипотермии и введении даларгина (M±m; n=8)

Группа

животных

АКТГ,

пг/мл

Кортизол, нМ/л

Тироксин, МЕ/л

1

Контроль

42,51±3,01

102,1±10,6

11,15±1,05

2

Даларгин + контроль

23,25±1,10

Р1-2<0,01

40,2±4,3

Р1-2<0,001

10,41±1,58

3

Гипотермия

52,25±4,42

Р1-3<0,01

172,1±7,7

Р1-3<0,02

7,42±1,20

Р1-3<0,02

4

Даларгин + гипотермия

27,31±2,62

Р1-4<0,001

Р3-4<0,001

148,3±7,0

Р1-4<0,05

Р2-4<0,02

10,87±0,53

Р3-4<0,01

Введение даларгина контрольным крысам приводит к значительному (на 45,3%) снижению содержания АКТГ в сыворотке крови (табл. 1). При гипотермии на фоне даларгина содержание АКТГ в сыворотке крови на 35,8% ниже, чем в контроле. Эти данные свидетельствуют о том, что опиоидный пептид существенно ослабляет стресс-индуцированную гиперстимуляцию кортикотропной функции гипофиза. Под действием даларгина у контрольных животных параллельно снижению содержания АКТГ, в плазме крови на 60,6% снижается содержание кортизола, что свидетельствует об ингибирующем влиянии даларгина на секрецию глюкокортикоида из надпочечников. Эти результаты согласуются с данными литературы об увеличении концентрации кортизола в плазме крови при введении блокатора опиоидных рецепторов налоксона (Coiro et al., Regulatory Peptides. – 2011. – Vol. 166. – P. 1-2.). При гипотермии на фоне даларгина содержание кортизола в сыворотке крови, в отличие от АКТГ, снижается в меньшей степени.

Введение даларгина контрольным крысам не влияет на содержание тироксина в сыворотке крови. При гипотермии даларгин полностью предотвращает падение уровня тироксина, обнаруженное при гипотермии без введения пептида.

Полученные результаты свидетельствуют об антистрессорном действии даларгина, направленном на профилактику истощения эндокринного статуса организма в условиях умеренной гипотермии.

Влияние даларгина на интенсивность

процессов перекисного окисления липидов тканей в норме

Инкубирование гомогенатов тканей in vitro в течение 30 мин. в аэрируемых условиях приводит к росту содержания МДА в мозге, печени, миокарде, скелетных мышцах в 12.2, 9.8, 2.2, 2.4 раза соответственно (табл. 2).

Таблица 2

Влияние даларгина (100 мкг/кг) на содержание МДА (нмоль/г) в гомогенатах тканей и плазме крови (мкмоль/л) крыс (M±m; n = 8-10)

Исследованная ткань

Контроль

Время введения даларгина

за 30 мин

за 120 мин

Мозг:

исходный уровень МДА

прирост МДА за 30 мин

31,3 ±1,94

382,1 ± 5,2

18,8 ± 1,56*

310,3 ± 12,0*

25,0 ± 2,41

264,7 ± 14,9*

Печень

исходный уровень МДА

прирост МДА за 30 мин

24,0 ± 1,72

235,1 ± 2,3

17,2 ± 2,1

116,5 ± 8,6*

18,0 ± 1,24

128,1 ± 11,3*

Миокард

исходный уровень МДА

прирост МДА за 30 мин

28,4 ± 1,12

52,2 ± 2,4

6,8 ± 0,58*

38,4 ± 1,8*

18,5 ±1,24*

24,3 ± 3,3*

Мышцы

исходный уровень МДА

прирост МДА за 30 мин

26,1 ± 2,10

61,4 ± 3,1

1,2 ± 0,21*

40,7 ± 3,0*

11,6 ± 1,06*

23,3 ± 3,0*

Плазма крови, мкмоль/л

1,99 ± 0,07

1,47 ± 0,08*

* – достоверные различия (р<0,05) относительно контроля

Более высокая интенсивность процессов ПОЛ в мозге по сравнению с другими тканями связана с физиологическими и биохимическими особенностями нервной ткани (Halliwell, J. Neurochem. – 2006.– V. 97. – P. 1634-1658).

Внутрибрюшинное введение даларгина за 30 минут перед декапитацией заметно подавляет процессы пероксидации липидов в тканях. Исходный уровень МДА при этом в мозге снижается на 39,5%, печени – на 28,3%, миокарде – на 76,1%, скелетных мышцах – на 95,4%, плазме крови – на 26,1% относительно контроля. Прирост МДА в инкубируемых гомогенатах исследованных тканей при этом также уменьшается. Как видно, под влиянием даларгина процессы ПОЛ снижается в большей мере в мышечных тканях. Различия в действии даларгина в исследованных тканях, по-видимому, связаны с неодинаковым поступлением даларгина в ткани (в связи разной скоростью кровотока, прохождением через гематоэнцефалический барьер и др.), а также с различиями в плотности опиоидных рецепторов в них.

При введении даларгина интактным животным за 2 часа до декапитации его ингибирующий эффект на процессы ПОЛ был также выражен, хотя и в меньшей степени, чем при более короткой экспозиции (табл. 2). Ослабление ингибирующего эффекта даларгина на процессы ПОЛ через 2 ч. после введения пептида возможно связано с его деградацией.

Для суждения о том, может ли даларгин оказывать прямое влияние на процессы ПОЛ или его действие опосредовано через гормональную, нервную, кровеносную системы, было исследовано влияние пептида на содержание продуктов липопероксидации в тканях в опытах in vitro.

Рис. 1. Влияние даларгина на содержание малонового диальдегида в тканях крыс в условиях in vitro. Даларгин вводили в среду гомогенизации тканей (0,1 М трис-HCl буфер рН 7,4) из расчета 10 мкг на 100 мл среды и инкубировал в этой же среде. ∗ – р< 0,05.

Оказалось, что при добавлении даларгина непосредственно к трис-HCl буферу, в котором проводили гомогенизацию и последующую инкубацию тканей, интенсивность образования МДА существенно понижается (рис. 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что даларгин может оказать не только опосредованное, но и прямое воздействие на процессы ПОЛ.

Влияние гипотермии и даларгина на

интенсивность генерации активных форм кислорода

Об интенсивности генерации АФК при гипотермии мы судили по содержанию мочевой кислоты и стабильных метаболитов NO в плазме крови. Полученные нами результаты позволили установить, что при гипотермии существенно ускоряется образование АФК. Об этом свидетельствует повышение уровня мочевой кислоты в плазме крови на 66,2% (табл. 3). Это означает, что при гипотермии активируется ксантиноксидаза эндотелиальных клеток печени, которая наряду с мочевой кислотой образует супероксид анион (Berry, Hare, J. Physiol. – 2004. – V. 555(3). – P. 589-606.).

Инъекция даларгина контрольным животным приводит к незначительному повышению (7,3%) содержания мочевой кислоты в плазме крови (табл. 3). При гипотермии на фоне даларгина в плазме крови мочевая кислота накапливается меньше, чем при гипотермии без введения пептида. Уменьшение образования мочевой кислоты под действием даларгина, по-видимому, является результатом ингибирования пептидом ксантиноксидазы (Короткина и др., Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1990. – Т. 59, № 2. – С. 145-146.), что приводит к уменьшению образования О2 EMBED Equation.3 и H2O2.

Таблица 3

Содержание мочевой кислоты и метаболитов оксида азота в плазме крови крыс при умеренной гипотермии и введении даларгина (M±m; n=8)

Группа

животных

Содержание

мочевой кислоты в плазме, мкмоль/л

Содержание

метаболитов оксида азота в плазме, мкмоль/л

1

Контроль

242,8±15,1

23,5 ± 1,7

2

Даларгин + контроль

254,6±20,4

32,7 ± 1,9

Р1-2 <0,01

3

Гипотермия

403,6±20,8

P1-3<0,01

40,0 ± 2,5



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст