Теоретическое обоснование и практическое использование молекуляр

На правах рукописи

Киль Владимир Ильич

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ЗАЩИТЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ И ОЦЕНКЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА БИОБЕЗОПАСНОСТЬ

Специальность: 06.01.07- защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Краснодар, 2010

Работа выполнена в государственном научном учреждении – Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) в 2001-2010 гг.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

Волчков Юрий Андреевич

доктор биологических наук,

Мироненко Нина Васильевна

доктор биологических наук,

Антонова Татьяна Сергеевна

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт им. П.П. Лукьяненко

Защита состоится 27 октября 2010 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом – на сайте ВАК: referat_vak@obrnadzor.gov.ru

Автореферат разослан и размещен на сайте « » июля 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Горьковенко В.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.

Значительный прогресс в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых к пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [Behura, 2006].

Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов и позже ДНК-маркеров, во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров, используемых сегодня – это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-маркеры позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы там, где этого не могут сделать никакие другие методы исследований. Использование ДНК-маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных насекомых – паразитов и хищников, так и вредителей. Кроме того, они могут использоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].

Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, в нашей стране в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].

Несмотря на то, что фенетические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, как правило, весьма значительна, что затрудняет оценку и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Использование для этих целей современных методов молекулярно-генетического анализа, в частности ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров, может во многом способствовать решению этих проблем. Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство популяций непосредственно на генетическом уровне и другие параметры, которые невозможно оценить с помощью морфологических критериев.

Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты. Существует также недостаток знаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК-технологий и в частности генной инженерии. Генетическая инженерия по сути продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает той же цели более эффективным и быстрым путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР) и некоторые виды ГМ-насекомых, которые нашли применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Однако их использование в нашей стране и в частности ГМ-растений сдерживается недостаточным изучением вопросов их экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось теоретическое обоснование применения молекулярно-генетических методов в практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных Bt-защищенных растений на экологическую безопасность и на этой основе разработка новых методов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.

Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:

Разработать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.

Изучить влияние инсектицидов, географического положения и условий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций насекомых-вредителей.

Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и Bt-картофелю и на этой основе разработать новые методы мониторинга резистентности вредных насекомых.

Усовершенствовать методы детекции и количественной оценки трансгенов в биоматериале.

Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.

Оценить пролонгированное влияние трансгенного (Bt) картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а именно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции картофельной минирующей моли, а также на жизнеспособность насекомых.

Научная новизна.

Разработаны новые системы описания рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Выявлены закономерности изменчивости фенетической структуры популяций насекомых под влиянием инсектицидов и других стрессовых факторов внешней среды. Показано, что чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций, как считалось ранее, но в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка, что ограничивает возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности этого вредителя к инсектицидам.

По данным молекулярно-генетических исследований показано генетическое сходство клопа вредная черепашка с другими представителями семейства Pentatomidae, что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.

Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 Новый.

Разработана математическая модель, позволяющая проводить прогноз развития резистентности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Разработан метод полуколичественной оценки содержания генетически модифицированных источников в зерне сои и соевой муке.

Разработан новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и метод оценки влияния Bt-картофеля на картофельную моль в ряду нескольких генераций насекомых.

Практическая значимость результатов исследований.

Разработаны системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Разработана методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.

Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, постоянно взаимодействующей с инсектицидом.

Разработаны новые методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале, которые предлагается использовать в целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов.

Разработан новый метод мониторинга резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Предложен подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки влияния Bt-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на этапе предрегистрационных испытаний Bt-картофеля.

Основные положения, выносимые на защиту:

Новые системы описания феноформ рисунка и окраски колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более эффективно проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, нежели традиционные. Фенетическая структура популяций насекомых определяется не столько пестицидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.

Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с использованием предлагаемой нами формулы расчета. Использование для этих целей фенетических маркеров необходимо рассматривать только в качестве предварительной, грубой оценки.

Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на обработке инсектицидом выборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей создания новых методов мониторинга и прогноза развития резистентности.

Новый подход для оценки пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки влияния трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на основе использования сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

Метод полуколичественной оценки на основе ПЦР по целевому гену устойчивости к гербициду раундап (СP4 EPSPS) для целей мониторинга генетически модифицированных источников в зерне и зернопродуктах сои.

Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг. «Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов» по этапу «Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на основе оптимизации их по экономической эффективности, биологической и экологической безопасности».

Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, а также научно-практических конференциях: Международной конференции «Трансгенные растения – новое направление в биологической защите растений» (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной научно-практической конференции молодых учёных «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (КубГАУ, Краснодар, 2001); Международной конференции «Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг», (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Биотехнология 2003» (Сочи, 2003); VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); 2-м Московском международном конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КубГАУ, 2003); Международной конференции «Биологическая защита растений – основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2004); IV Семинаре-совещании «Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2005); международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005); 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес» «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность» (2006,Пущино); Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений – основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар.2006); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (пос. Агой туапсинского р-на-2006, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона» (Ставрополь, 2007); 13 съезде Русского энтомологического общества (Краснодар.2007); международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург–Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений – основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2008); II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2009); Х сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроценозах» (Киев, 2009).

Работа поддержана субвенциями Миннауки: «Оценка биологической эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и разработка методов оценки их биоценотической безопасности», а также РФФИ и администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644, 09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТЦ №3768.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях — в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций, списка литературы и четырех приложений; содержит 48 таблиц и 60 рисунков. Список литературы содержит 404 источника, из них 66 на русском языке.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность всем соавторам проведенных исследований: сотрудникам сектора биотехнологии, к.б.н. А.П. Савве и сотрудникам лаборатории гербологии; Ж.А.Ширинян, к.б.н. М.В.Пушне и другим сотрудникам лаборатории массового разведения и применения энтомоакарифагов; к.б.н. И.С. Агасьевой и сотрудникам лаборатории поддержания гос. коллекции энтомоакарифагов; д.б.н. О.Д. Ниязову, д.б.н. В.Г.Коваленкову, а также зам. директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я.Исмаилову и директору ВНИИБЗР академику РАСХН, профессору В.Д.Надыкте за помощь и поддержку в проведении данных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты

растений от вредных насекомых

В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Приводится описание техники трансформации членистоногих для создания трансгенных и паратрансгенных насекомых и их использование в программах биологической защиты растений.

Описывается современное состояние исследований по выращиванию генетически модифицированных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и преимущества их возделывания, а также вопросы экологической безопасности генетически модифицированных растений, устойчивых к вредным насекомым.

Глава 2. Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: полужесткокрылые Hemiptera (клопы Nezara viridula, Graphosoma lineatum, Dolicorys baccarum, Eysarcoris incospicnus, Piesodorus lituratus, Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus, Eurygaster integriceps, Perillus bioculatus, Podisus maculiventris); жесткокрылые Coleoptera (колорадский жук Leptinotarsa decemlineata); двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana); чешуекрылые Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella; картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella; хлопковая совка Helicoverpa armigera), а также растения картофеля (Bt-защищённые сорта картофеля Супериор Ньюлиф («Монсанто», США), Луговской-плюс (Центр «Биоинженерия» РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR («Монсанто», США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR («Монсанто», США).

Молекулярно-генетический анализ.

Основным методом молекулярно-генетических исследований являлась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, ISSR-PCR) и электрофорез в агарозном геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) и термоциклере «iCycler» (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и ISSR-анализ проводили одновременно в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов (Диалат ЛТД, Москва). Сравнение выборок проводили по воспроизводимым и четко детектируемым ДНК-фрагментам.

SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл реакционной смеси на термоциклере «Терцик» по одной из следующих программ:

— режимы амплификации для 35S-промотора, NOS-терминатора, гена актина сои: 3 минуты 30 секунд при 94°С – предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94°С, 40 секунд отжиг праймеров при — 54°С, 60 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72°С.

— режимы амплификации для генов CP4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минуты при 94°С – предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С, 45 секунд отжиг праймеров при — 60°С, 25 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 10 минут при 72°С.

— режимы амплификации для гена Cry3A: 10 минут при 94°С – предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при — 60°С, 30 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 7 минут при 72°С.

Электрофорез продуктов амплификации (SCAR-PCR) осуществляли в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электрического поля 5В/см.

Визуализацию ампликонов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat).

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 50 µM каждого dNTP, 0,4µM каждого из праймеров, 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере iCycler (BioRad) с предварительной денатурацией (940С 2 мин) в режиме: денатурация — 940С 30с, отжиг праймера – 580С 40с (для Сp2.39; Сp2.157; HaSSR1; HaSSR3) и 610С 40с (для Сp1.63), элонгация — 720С 40с (35 циклов), конечный синтез — 720С 3 мин.

Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, толщиной 1 мм при напряжении 300-400 вольт в течение 4-5 часов.

Статистический анализ данных.

Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона. Генетическое разнообразие оценивали по Шеннону с использованием формулы: H= — Σ (pi × ln pi), где pi — частота i-го аллеля в выборке [Chalmers, 1992], а также другим методом — по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров.

Сравнение средних по выборке проводили по критерию Стьюдента, канонический дискриминантный анализ – с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили методом UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetical Averages), определение генетических расстояний между генотипами — по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ Treecon [Van de Peer, De Wachter, 1994].

Глава 3. Фенетические маркеры в изучении генетической структуры

популяций вредных и полезных насекомых

Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи пришли к выводу о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследованиях. Несомненно, использование фенетических маркеров, по сравнению с молекулярными, в популяционных исследованиях обладает рядом преимуществ и, прежде всего, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых мы будем говорить ниже.

Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов

Целью данного этапа исследований явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка на этой основе метода прогноза развития резистентности к Bt-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задача разработать новую систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука.

В настоящее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata проводят, главным образом, по рисунку переднеспинки взрослых особей в соответствии с методикой, разработанной Фасулати (1986). Однако, по нашим данным, данный подход не учитывает всего многообразия феноформ в популяции и в частности слияние феноформ «A» внизу между собой и с фенокомплексами «P» и «M». Поэтому мы предложили использовать дополнительно к девяти феноформам (по Фасулати) еще фенокомплексы группы «А», описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами впервые: VР; HР; VHР; HY (рисунок 1).

Такой комплексный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов, оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где наиболее часто встречался именно описанный нами фенокомплекс НР (в среднем примерно 30%) (таблица 1).

Оценка выживаемости под действием стрессового фактора наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан). Выживаемость особей колорадского жука в условиях

Тип №1 Тип №2 Тип №3

Тип №4 Тип №5 Тип №6

Тип №7 Тип №8 Тип №9

Рисунок 1 — Основные типы (феноформы) рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 — по Фасулати, 1986; V, H, VH, Y — по Кохманюк, 1982; VР; HР; VHР; HY — по Киль и др., 2004)

Таблица 1 — Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского края, % (2001-2003 гг.)

Феноформа

Популяция

краснодарская

темрюкская

староминская

1

4,7

4,3

5,0

2

3,7

1,2

1,7

3

14,0

10,1

10,3

4

1,0

2,0

1,8

5

2,6

2,0

2,2

6

13,6

13,7

13,2

7

1,2

3,0

2,4

8

0,8

2,4

2,1

9

10,7

13,9

12,0

V

2,2

3,4

1,5

Y

4,0

5,0

3,7

VP

1,7

0,2

3,2

HP

27,6*

27,5*

32,1٭

HY

5,5

2,7

3,5

H

4,6

6,5

2,7

VHP

1,4

2,0

2,6

VH

0,1

0,1

0,2

*-достоверно отличается от других феноформ ( tфакт. ≥ t 0,5 )

пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые насекомые краснодарской популяции фенокомплекса VP являлись наиболее толерантными к инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а часто встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались невысокой выживаемостью в условиях стресса (в среднем =12,9; 16,4% соответственно). Это указывало на то, что фенетическая структура популяций колорадского жука определяется не только пестицидным, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды. По всей видимости, чувствительность различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука.

В то же время обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) жуков часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по своему механизму действия стрессовые факторы. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать следующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа показывали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались наименьшей дисперсией (σ²), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При этом данная закономерность прослеживалась для всех трех исследованных популяций и в течение двух лет испытаний. Вероятно, данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды (засуха, холод, зной и др.), что в конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях (специфическая устойчивость к инсектицидам этих феноформ в большинстве случаев ниже среднего).

Становится понятным роль редких феноформ в структуре популяций колорадского жука. Скорее всего, именно эти фенетические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, например, к воздействию пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В дальнейшем эти, первоначально редкие феноформы насекомых, ставшие впоследствии доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре.

Несомненно, интересным представлялась возможность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых.

Фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка

В нашей стране популяционные исследования клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps традиционно проводятся на основе феноформ рисунка щитка взрослых особей и в частности в Институте Защиты Растений (Санкт-Петербург) [Фасулати, 2005]. Некоторые исследователи отмечают адаптивный характер феноформ клопов под действием инсектицидов [Фасулати, 2005; Махоткин, Махоткина, 2006]. В то же время существующая система описания фенетической структуры популяций базируется только на пяти фенокомплексах, что с нашей точки зрения явно недостаточно и требовало усовершенствования. При этом важно было определить, носят ли выявленные выше закономерности формирования фенетической структуры популяций универсальный характер, то есть какую роль в адаптивности популяции играют редкие и часто встречаемые феноформы у других видов насекомых, а именно клопа вредная черепашка.

В рамках указанной проблемы на данном этапе исследований ставилась задача разработать новую систему описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, изучить влияние условий года, географического положения и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций.

Новая система описания фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка

Нами была разработана новая система описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, которая так же, как и система Фасулати (2005), базировалась на сочетании признаков рисунка и окраски частей тела насекомого. Предложенная нами система описания включала в себя 15 фенокомплексов щитка и 10 морфотипов брюшка (таблицы 2 и 3).



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | ... | Вперед → | Последняя | Весь текст