Способ получения пробиотика субтилбен в форме таблеток и его про

На правах рукописи

САИДОВ ШАМСУЛЛО ХУРСАНДОВИЧ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИКА СУБТИЛБЕН

В ФОРМЕ ТАБЛЕТОК И ЕГО ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ ТЕЛЯТ

16.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Душанбе – 2012

Работа выполнена в Таджикском научно- исследовательском ветеринарном институте и Таджикском аграрном университете имени Ш.Шотемур

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор, академик ТАСХН Саттори И.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Муминов А. М.

кандидат ветеринарных наук Каримов М. Ш.

Ведущая организация: НПП «Биологические препарат» Таджикской

академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится-ноября 2012 г. в 1000 ч на заседании диссертационного совета Д 050.001.01 при Институте ветеринарии Таджикской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 734005, г. Душанбе, ул. Каххорова, 43, тел. (992-372) 27-39-95

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарии ТАСХН

Автореферат разослан 28 октября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук

З.Д. Ашурова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ведущее место среди причин гибели телят занимают желудочно-кишечные болезни, наносящие огромный ущерб животноводству.

В новых экономических условия хозяйствования проблема повышения эффективности лечебно-профилактических мероприятий при желудочно-кишечных болезнях различной этиологии (незаразные, бактериальные, вирусные, при воздействии микотоксинов и др.) является актуальной для ветеринарной медицины (Архангельский И. И. и др., 1960; Анохин Б. М., 1980; Коромыслов Г. Ф., 1980; Аликаев В. А. и др., 1981; Самохин В. Т., 1981; Соколова Н. Л. и др., 1982; Урбан В. П., 1985; Воронин Е. С. и др., 1990; Шахов А. Г., 2000; Гаффаров Х. З. и др., 2002 и др.).

Для борьбы инфекционными энтеритами телят широко применяют антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны и другие химиопрепараты, бесконтрольное использование которых имеет вредные последствия: отрицательное влияние на формирование иммунитета и характер иммунологических реакций, нефротоксическое и гепатотоксическое действия, неблагоприятное влияние на нервную и кроветворную системы, аллергия и дисбактериозы, возникновение устойчивости микроорганизмов к этим лекарственным средствам.

Увеличение устойчивых к антибиотикам и сульфаниламидам бактерий в организме животных и окружающей среде снижает эффективность лечебных и профилактических мероприятий и приводит к тяжелым экологическим последствиям.

В последние годы для борьбы с желудочно-кишечными и респираторными болезнями и повышения продуктивности молодняка сельскохозяйственных животных широко применяют различные симбиотические микроорганизмы, среди которых наиболее перспективными признаны молочнокислые, пропионовокислые, бифидобактерии, Bacillus subtilis и др., проявляющие избирательную антагонистическую активность в отношении патогенной кишечной флоры, эффективно и быстро восстанавливающие микробиоценоз кишечника (Антипов В. А., 1991; Панин А. Н. и др., 1993, 1999; Паршин П. А. и др., 1997; Малик Н. И. и др., 2000, 2001 и др.).

Основные преимущества пробиотиков в сравнении с другими антимикробными препаратами – высокая эффективность, отсутствие побочных эффектов и экономичность (Шахназаров В. Ю., 1990; Проскурин Ю. Н., 2000; Стечин Б. Т. и др., 2005 и др.).

Установлено, что использование пробиотиков из представителей эндогенной микрофлоры для лечения и профилактики энтеритов животных недостаточно эффективно из-за слабой противобактериальной активности этих препаратов, которая значительно выше у препаратов на основе спорообразующих бактерий B. subtilis.

Вышеизложенное обусловливает актуальность настоящей работы, целью которой явиллсь разработка эффективного при сальмонеллезе телят пробиотического препарата на основе местных штаммов B. subtilis и исследование профилактическое эффективность этого препарата.

Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

1. Изучить распространение сальмонеллеза телят в животноводческих хозяйствах Республики Таджикистан.

2. Разработать таблетированной формы пробиотика Субтилбен, изучить ее антагонистическую активность и исследовать физико-химические и биологические свойства препарата.

3. В экспериментальных и производственных условиях определить профилактическую эффективность пробиотика субтилбен при сальмонеллезе телят.

Научная новизна. Изучено распространение особенности распространение сальмонеллеза телят в животноводческих хозяйствах республики в новых условиях хозяйствования.

Разработан споосб изготовления пробиотический препарат субтилбен на основе местных штаммов B. subtilis (Патенты TJ 390, TJ 391), отработаны методы изготовления и контроля таблетированной формы препарата, изучены его антимикробные свойства, безвредность и стабильность.

Определена профилактическая эффективность субтилбена при сальмонеллезе телят и отработан рациональный способ применения препарата.

Практическая ценность. На основании полученных результатов пробиотик субтилбен предложен в качестве противобактериального препарата.

Материалы диссертации вошли в:

— наставление по применению иммунобиотика субтилбен для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней животных и пчел (утв. ГУВ МСХ РТ 25.11.2004 г.);

— Решение 26-го заседания Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ от 24.11.2004 г. (Душанбе) о практическом использования препарата субтилбен в ветеринарной практике СНГ.

-Рекомендации по профилактике пневмоэнтеритов телят (утв. ГУВ МСХ РТ 2012).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

— результаты изучения распространения сальмонеллеза телят в животноводческих хозяйствах республики;

— технология изготовления и методы контроля физико-химических и биологических свойств таблетированной формы пробиотика субтилбен;

— результаты изучения антибактериальной активности и безвредности субтилбена;

— результаты экспериментальных и производственных испытаний эффективности препарата при сальмонеллезе телят.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях ученого совета Таджикского научно-исследовательского ветеринарного института (ТаджНИВИ) (2003 – 2005гг и Таджикском аграрном университете (2006-2010 гг)); республиканских конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе, 2005 – 2010 гг.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003 г.), посвященной 60-летию ТаджНИВИ;

26-ом заседании Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ (Душанбе, 2004 г.), международной конференции посвящиной 80 летию образования ТАУ имени Ш.Шотемур

Публикации. По результатам исследований опубликованы 6 научных работ, получены 2 патента РТ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводы, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация изложена на 108 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 7 рисунками. Список литературы содержит 209 источников. В приложение включены материалы, подтверждающие внедрение результатов исследования в практику.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2000 – 2010 гг. в лабораториях вирусологии ТаджНИВИ и микробиотехнологии Таджикского аграрного университета (ТАУ) в соответствии с республиканской научно-технической программой «Разработать и внедрить новые высокоэффективные комплексные препараты по профилактике и терапии респираторно-кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных» на 2001 – 2005 гг., зарегистрированной в Национальном патентно-информационном центре (НПИЦентр) РТ (№ госрегистрации 00000967).

Научно-производственные опыты, апробация и производственная проверка полученных результатов проведены в 13 животноводческих хозяйствах РТ.

Диагностические исследования. Сальмонеллез диагностировали на основании анализа эпизоотологических данных с учетом клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования патологического материала от больных, павших и вынужденно убитых больных телят.

Животные. Эксперименты проводили на 162 белых мышах (массой 18 – 20 г), 81 кролике породы шиншилла (массой 2,5 – 2,7 кг), 326 телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг), производственные испытания – 590 телятах черно-пестрой породы (массой 31 – 33 кг). Разброс в экспериментальных группах по исходной массе тела не превышал 10%.

В работе применяли разработанный пробиотик субтилбен, представляющий собой комплекс взвеси микробных клеток местных штаммов (BS TJ 09, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26) B. subtilis и минеральных и растительного веществ.

При разработке субтилбена использовали 3 штамма B. Subtilis: BS TJ 09, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26.

Для стандартизации и контроля качества таблетированной формы субтилбена, а также изучения его стабильности при хранении разработаны методы качественного и количественного контроля препарата.

Физико-химические свойства таблетированной формы субтилбена

Внешний вид, наличие механических примесей, плесени определяли визуально при рассмотрении отобранных образцов при хорошем естественном освещении на белом фоне на расстоянии 25 – 30 см от глаз.

Концентрацию водородных ионов (рН) 10% водной суспензии определяли потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 175).

Массовую долю влаги определяли по ГОСТу 24061-89.

Биологические свойства субтилбена

Однородность определяли методом микроскопии.

Подсчет количества микробных клеток (м.к.) B. subtilis. Культуру разводили физиологическим раствором в 10 – 15 раз и заправляли суспензией подготовленную камеру Горяева, в 5 квадратах которой под микроскопом определяли количество м.к. и рассчитывали их число в 1 см3.

Определение количества жизнеспособных клеток B. subtilis. В пробирку, содержавшую 1 г субтилбена добавляли 9 см3 стерильного физиологического раствора, после тщательного перемешивания 0,5 см3 суспензии переносили во вторую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора, из которой 0,5 см3 разведенной суспензии – в третью, из третьей – в четвертую, из четвертой – в пятую, из пятой – в шестую пробирку с 4,5 см3 физиологического раствора.

Из последней (шестой) пробирки по 0,5 см3 суспензии пипеткой засевали в шесть чашек Петри с агаром СБД (комплекс минеральных и растительного компонентов), колебательными движениями распределяя суспензию по всей поверхности агара. Культивировали 36 ч при 37оС, после чего учитывали результаты исследования (определяли количество больших и малых по диаметру колоний).

Стерильность субтилбена определяли по ГОСТу 28085-89.

Для исключения контаминации микоплазмами производили посевы проб субтилбена на среду Эдварда (жидкую, полужидкую и твердую), обогащенную 20% сыворотки крови лошади, 10% дрожжевого экстракта, 0,5% глюкозы с добавлением фенол-рота в конечной концентрации 0,001%.

Изучение антагонистических свойств субтилбена в сравнительном аспекте (контроль – бактерин-SL) проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой и плотной питательной средах на музейных штаммах (3) и изолятах, S. dublin (3) выделенных от больных телят в животноводческих хозяйствах РТ.

Идентификацию сальмонелл, изучение антагонистической активности B. subtilis в отношении S. bublin проводили при участии Хасанова Н. Р.

Динамику антагонистической активности субтилбена в отношении односуточной бульонной культуры S. dublin (концентрация – 1 млрд м.к./мл) определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде (контроль – силикат алюминия с примесью силикатов магния и кальция).

Токсические свойства субтилбена

Безвредность субтилбена изучали в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (М., 1988).

Испытание на токсичность проводили по ГФ XI (вып. 2, с. 182).

Для изучения профилактической эффективности субтилбен вводили перорально с водой или молоком в дозе 0,2; 0,4 и 0,6 г/кг массы тела один раз в сутки в течение 15 дней.

Экономическую эффективность научных разработок рассчитывали согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (утв. ГУВ МСХ СССР в 1982 г.), а также в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений» (утв. МСХ СССР в 1983 г.).

Методики отдельных экспериментов изложены в соответствующих разделах диссертации.

Цифровой материал диссертации обработан статистически по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при p≤0,05 (Лакин Г. Ф., 1990).

За основу выводов и практических предложений взяты результаты контролируемых опытов в лабораторных и производственных условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Распространение сальмонеллеза телят в хозяйствах Республики Таджикистан

Бактериологическим исследованием патологического материала больных телят с симптомкомплексом расстройства желудочно-кишечного и респираторного тракта доказано, что в возникновений этих болезней на молочно-товарных фермах Таджикистана большую роль играет S. dublin. Вероятность возникновения и тяжесть течения болезни определяют внешние факторы, влияющие на естественную резистентность и иммунологическую реактивность организма телята.

Результаты исследования 382 проб патологического материала (фекалии, кровь, паренхиматозные органы) от телят из 13 животноводческих хозяйств районов республиканского подчинения (РРП), Хатлонской и Согдийской областей РТ представлен табл. 1

Таблица 1

Результаты бактериологического исследования

патологического материала от телят

Количество хозяйств

Количество проб

всего

неблагополучных

всего

положительных

РРП

7

5

265

107 (40,3)

Согдийская область

3

1

40

4 (10,0)

Хатлонская область

3

2

77

16 (20,7)

Итого

13

8

382

127 (33,2)

Примечание. В скобках указано процентное значение.

Наибольшее количество больных телят (40,3%) выявлено в хозяйствах РРП, наименьшее (10,0%) – Согдийской области.

E. coli c ассоциации патогенов Pr. vulgaris выделено в 68,2% случаев, E. coli с S. dublin 1 20,4% и ассоциации трех возбудителей потогенов E. coli, Pr. vulgaris и S. dublin обнаружена в 11,4% случаев (рис 2)

Потогенные возбудители болезней желудочно-кишечного и респираторного тракта телят в отдельности дисиросировали 71,9 и в ассоциации в 28,1% случив. Как видно из рис.1 E. coli обнаружено в 49,9, S. dublin-12,1 и Pr. vulgaris в 9,9% случаев ассоциации патогенов

Рис. 1. Соотношение возбудителей болезней телят в отдельность молодняка и ассоциации, %.

SHAPE \* MERGEFORMAT

Рис. 2. Соотношение ассоциаций потогенов болезней телят в хозяйствах Таджикистана, %.

Таким образом, S. dublin как в отдельности, так и в ассоциации с другими патогеннами являются возбудителями желудочно-кишечных и расператорных болезней молодняка КРС, что обусловливает актуальность разработки новых ротивобактериальных лекарственных средств и рациональных способов их применения.

3.2. Технология изготовления пробиотика субтилбен в форме таблеток

3.2.1. Состав. Для успешной профилактики и лечения бактериальных желудочно-кишечных и респираторных болезней необходима одновременная обработка большого поголовья, поэтому наиболее удобной и эффективной лекарственной формой является таблетки для перорального применения.

В состав субтилбена входят: бентонит, пектин, взвесь м.к. штаммов B. subtilis BS TJ 09, BS TJ Д 24, BS TJ Д 26 (1:1:1) 25 – 30 млрд м.к./г и остальное формообразующие компоненты

3.2.2. Технология Основные технологические стадии производства субтилбена в форме таблеток следующие:

1. Получение матричных культур. С полужидкого агара культуру производственных штаммов B. subtilis засевают в пробирку с питательным бульоном СДБ и выращивают в течение 1 – 24 ч при 37оС. Культуры проверяют на чистоту и вновь засевают в матрасы, наполненные питательной средой не более 2/3 объема. Через 18 – 24 ч инкубирования культуры B. subtilis проверяют на чистоту и используют для изготовления производственной серии биомассы.

2. Изготовление производственной серии биомассы. Чистые культуры 24-часового роста в количестве 5%-ного объема засеваемой среды инокулируют в 10-литровые бутыли, наполненные средой СДБ (рН 7,4 – 7,6), и выращивают при 37оС в течение 48 ч. Затем культуры штаммов BS TJ 09, BS TJ Д 24 и BS TJ Д 26 B. subtilis смешивают в равных количествах. Полученный гомогенат перемешивают с бентонито-пектиновой смесью.

3. Сушку производственной серии биомассы осуществляют методом контактно-сорбционного обезвоживания на бентонитопектиновой смеси в сушильном шкафу при 40 – 50оС в течение 48 – 72 ч. Концентрация биомассы культур B. subtilis в порошке – 25-30 млрд м.к. с содержанием 90 – 100% спор.

4. Изготовление таблетки Приготовленную смесь гранулировали через сито с диаметром отверстий 3 мм и равномерно распределяли по поддону с толщиной слоя не более 10 мм.

Массу выдерживали в течение 24-36 часов при температуре 37°С, а затем гранулировали через сито с диаметром отверстий 2 мин. В качестве вспомогательных веществ использовали крахмал, сахарный сироп и кальция стеарат.

Полученные таблетки имели минимальное отклонение по массе (от 2 до 2,6%), высокие значения по прочности (от 0,8 то 1,5 МПа) и соответствующее количество бацилл.

Результаты оценки качества таблеток субтилбена в соответствии с требованиями ФС 42-34 76-98 и ГФ показали, что таблетки по внешнему виду является круглой формы беловато-серого цвета, мраморного характера. КОЕ достигает 7,5 млрд. кл/дозе, распадаемость не более 15 мин., РН – 6,8, массовая доля влаги 4,1%, посторонней микрофлоры не имели, антимикробная активность достигает 15,6-31,2 млн м..к. и безвреден для животных.

3.3. Изучение стабильности свойств таблеток субтилбена в процессе их хранения

С целю изучения стабильности свойств субтилбена в таблетках на хранение в сухом защищенном от света месте при температуре не вышн 300С. В результате проведенных исследований образцов в течение 36 месяцев было установлено, что сохраняюшь обоих штаммов Bacillus subtilis составила 65-70%, остальные показатели не изменялись.

Таким образом, можно сделать заключение, что таблетки субтилбена после хранения в течение 36 месяцев соответствуют представленным требованиям ФС 42-34 78- 98 и ГФ

3.4. Изучение воспроизводимости технологий получения

таблеточной формы субтилбена

Для определения воспроизводимости технологий получения субтилбена в форме таблетки и оценки их свойства было приготовлено 5 серии таблеток.

Приготовление субтилбена в форме таблеток проводили в соответствие с разработными схемами получения препарата.

Результаты исследования качества таблеток субтилбена, как видно из табл. 3 отвечают требованиям ФС 42-3476-98 и ГФ.

Разработаны регламент получения таблеток субтилбена включен в НТД на пробиотик субтилбен.

Таблица 3

Показатели качества субтилбена

в форме таблеток

Показатель

Требования

Серии таблеток

1

2

3

4

5

Внешний вид

таблетки круглой формы, беловато-серого цвета мраморного характера

соот-

вет-

ствует

соот-вет-ствует

соот-вет-ствует

соот-вет-ствует

соот-вет-ствует

КОЕ млрд/кл/дозе

1,5 – 2,0

2,2

2,2

2,5

2,0

2,6

Распадаемость, мин

60 не более

15

16,0

20

15

10

РН

5,5-8,0

5,9

6,5

6,8

6,0

7,0

Массовая для влаги, %

8,0 не более

3,0

3,5

3,2



Страницы: 1 | 2 | Весь текст