Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическу

На правах рукописи

МАКАРЕНКО ВЛАДИСЛАВ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

РОЛЬ ЭНДОТЕЛИЯ В МЕХАНИЗМАХ ОТВЕТА НА ПРЕРЫВИСТУЮ НОРМОБАРИЧЕСКУЮ ГИПОКСИЮ

03.00.04 – биохимия

03.00.13 — физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Барнаул — 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Алтайском государственном медицинском университете Росздрава (г. Барнаул)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ельчанинова Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор медицинских наук, профессор Кривощеков Сергей Георгиевич

Ведущая организация: Государственное учреждение Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Защита состоится « » 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3833-33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «___» ___________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Русских Г. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Общепризнано, что продуцируемые эндотелием биологически активные вещества играют ведущую роль в регуляции функциональной активности, пролиферации и апоптоза клеток сосудистой стенки, ее взаимодействия с форменными элементами и компонентами плазмы крови (Pohlman T.H., Harlan J.M., 2000; Galley H.F., Webster N.R., 2004; Marti H.H., 2005). Скорость синтеза и секреции эндотелиальных факторов, в свою очередь, регулируются множеством вазоактивных сигнальных молекул — ацетилхолином, брадикинином, ангиотензином II и другими, а также локальными изменениями скорости кровотока (Karimova A., Pinsky D.J., 2001; Michiels C., 2003). Одним из мощных факторов модулирующих метаболизм эндотелиоцитов является гипоксия (Faller D.V., 1999; Michiels C. et al., 2000; Li J.M., Shah A.M., 2004; Jernigan N.L. et al., 2004; Fike C.D. et al., 2005).

Воздействие разными вариантами гипоксии и, в частности, прерывистой нормобарической гипоксией (ПНГ) уже долгие годы используется для профилактики и лечения многих хронических заболеваний, повышения неспецифической резистентности организма (Меерсон Ф.З., 1973; Караш Ю.М. и др., 1986; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001). Установлено, что под влиянием курса ПНГ у здоровых людей развивается комплекс адаптивных изменений в различных системах организма, включающий возрастание потребления и эффективности использования кислорода, увеличение кислородной емкости крови, уменьшение реактивности симпатоадреналовой системы (Горанчук В.В. и др., 2003; Кривощеков С.Г. и др., 2004; Serebrovskaya T.V. et al., 2005).

Показано изменение артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса резистивных сосудов при ПНГ у здоровых людей, а также нарушений гемодинамики у больных с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Ельчанинова С.А. и др., 2002, 2008; Потиевская В.И., 2005). Анализ данных литературы позволил нам предположить что, механизмы адаптивных преобразований сердечно-сосудистой системы под воздействием ПНГ включают изменения функционирования эндотелия, его активацию с развитием устойчивости к действию повреждающих факторов.

Цель работы: Изучить роль эндотелия кровеносных сосудов в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию.

Задачи исследования:

Исследовать влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей – концентрацию в крови эндотелиальных микрочастиц CD31+, большого эндотелина-1 1-38, васкулярного эндотелиального фактора роста.

Изучить влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели окислительного стресса и активность внутриклеточных антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, у здоровых людей.

В первичной культуре эндотелиальных клеток человека оценить воздействие прерывистой нормобарической гипоксии на показатели состояния межклеточных контактов, участие в их изменениях активных форм кислорода.

Исследовать изменение продукции активных форм кислорода, накопления тиобарбитуратреактивных продуктов в первичной культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

Изучить динамику концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста в клеточной среде первичной культуры эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

Оценить влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов — HIF-1α и HIF-2α, в клетках первичной культуры эндотелиоцитов человека.

Научная новизна.

Впервые показано, что механизм воздействия ПНГ (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей включает снижение концентрации в крови маркеров повреждения эндотелия на фоне повышения концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста, активности внутриклеточных антиоксидантных ферментов и снижения концентрации продуктов перекисного окисления липидов.

На культуре эндотелиоцитов человека впервые показано, что ПНГ оказывает прямое влияние на эндотелиоциты: приводит к опосредованному активными формами кислорода кратковременному ослаблению межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, возрастанию продукции васкулярного эндотелиального фактора роста накоплению в эндотелиоцитах индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-1α и HIF-2α.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты работы свидетельствуют об участии эндотелия в механизмах адаптации к прерывистой нормобарической гипоксии, о возможности формирования не опосредованного системными регуляторными факторами ответа эндотелиоцитов на это воздействие.

Установленные закономерности указывают на перспективность исследования применения ПНГ для первичной профилактики артериальной гипертензии и атеросклероза — заболеваний сердечно-сосудистой системы, центральным звеном патогенеза которых является дисфункция эндотелия.

Положения, выносимые на защиту.

У здоровых людей курс прерывистой нормобарической гипоксии вызывает транзиторную активацию эндотелия, которая проявляется увеличением в крови концентрации эндотелиальных CD31+ микрочастиц, большого эндотелина-1 1-38, концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста, и сопровождается кратковременным усилением окислительного стресса и повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.

В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования воздуха с гипоксической газовой смесью, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом между сеансами) вызывает формирование не опосредованных системными регуляторами приспособительных реакций эндотелиоцитов, включающих зависимое от активных форм кислорода кратковременное ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, ослабление индуцированного гипоксией окислительного стресса, прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста.

Механизм реализации эффектов прерывистой нормобарической гипоксии на эндотелиоциты включает активацию системы индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-1α и HIF-2α.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на III научной конференции «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003), VI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2004), VII научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), совместном заседании кафедр биохимии и физиологии (Барнаул, 2009), проблемной комиссии по физиологии и патофизиологии сердечно-сосудистой системы ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (Барнаул, 2009).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственного исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 204 литературных источников, из них 55 — на русском языке и 139 — на иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев (10 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 31 до 35 лет (средний возраст 33±2 год). Курс ПНГ, который проводили с использованием установки БиоНова-204 (Россия), включал 20 ежедневных сеансов продолжительностью 60 минут. Сеанс состоял из 6 циклов длительностью 10 минут, в которых вдыхание через маску гипоксической газовой смеси с содержанием кислорода 10-12 об.% чередовалось с вдыханием атмосферного воздуха в циклическом режиме. Длительность вдыхания гипоксической смеси в цикле увеличивалась от 1 до 5 мин в первые четыре дня курса, а затем составляла 5 мин. Согласно рекомендациям Минздрава СССР (Стрелков Р.Б. и др., 1985), длительность дыхания гипоксической газовой смесью в первые сеансы ПНГ назначали в зависимости от результатов пробы Штанге — продолжительности задержки дыхания на вдохе.

Для исследования эффектов ПНГ в эксперименте in vitro была использована первичная культура клеток эндотелия микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ, HMVE-L), полученная от Lonza Walkersville, Inc. (США). Культура ЭМСЛЧ выращивалась в пластиковых чашках Петри (диаметр 100 мм) с использованием стандартной жидкой среды для эндотелиоцитов Clonetics EGM-2-MV BulletKit (Lonza Walkersville, Inc., США) на основе базисной среды 2 для эндотелиальных клеток с добавлением гентамицина, амфотерицина-В, гидрокортизона, эмбриональной телячьей сыворотки и необходимых факторов роста. Клетки выращивались в атмосфере, содержащей 21 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа и 74 об.% азота. Для оценки эффектов ПНГ были использованы ЭМСЛЧ седьмого-девятого пассажа, достигшие 80-100% конфлюентности. Воздействие ПНГ проводили с использованием инкубатора «Steri-Cult 200 Incubator» (Thermo Scientific, США), в который помещали герметичную пластиковую камеру размером 20х25х15 см. Чашки с культурой ЭМСЛЧ располагали в центре камеры. Во время сеанса нагретая до 37°С газовая смесь постоянно поступала в камеру, отработанная смесь через выводящий клапан выводилась наружу. Объем и скорость поступления газовой смеси в камеру осуществлялась соленоидными клапанами автоматического дозатора газов «Flowmeter». Попеременно использовали готовые газовые смеси: нормоксическую (20 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 75 об.% азота) и гипоксическую (1 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 94 об.% азота). Воздействие включало три одночасовых сеанса ПНГ, каждый из которых состоял из 6 циклов чередования 5-минутной нормоксии и 5-минутной гипоксии. Повтор сеанса проводили после одночасового периода нормоксии.

При разработке схемы воздействия ПНГ in vitro ставилась задача максимально приблизить ее параметры к схеме гипоксической тренировки in vivo. В конце периода вдыхания гипоксической газовой смеси в капиллярной крови здоровых участников исследования парциальное давление кислорода снижалось от 83-108 до 35-45 мм рт. ст. В культуральной среде в процессе ПНГ парциальное давление кислорода в течение 5 минут пропускания гипоксической смеси через камеру снижалась от 80 до 35-45 мм рт ст. Длительность нормоксии между сеансами была подобрана в предварительных экспериментах с учетом длительности сохранения жизнеспособности культуры, оцениваемой по восприятия красителя трепанового синего.

Уровень артериального давления (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли с использованием автоматического измеряющего устройства A&D M400 (Япония). Коньюктивальную биомикроскопию проводили с помощью щелевой лампы ЩЛ-2 (Россия), установленной горизонтально на подвижном штативе (увеличение в 16 раз). Оценку микроциркуляции проводили по методу В.С. Волкова и соавторов (1976) с вычислением конъюктивального индекса – суммы баллов признаков нарушения микроциркуляции. Выраженность окислительного стресса оценивали по общей прооксидантной активности (ОПА), которую оценивалась по накоплению в модельной системе продуктов перекисного окисления ТВИН-80, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (Галактионова Л.П. и др., 1998) и концентрации в плазме крови тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) (Владимиров Ю.М., Арчаков А.И., 1972). Активность антиоксидантных ферментов исследовали в гемолизате эритроцитов и рассчитывали на единицу массы гемоглобина, определенного гемоглобинцианидным методом (Меньшиков В.В. и др., 1987). Активность супероксиддисмутазы определяли по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия супероксидом (Чевари С.И. и др., 1991); активность каталазы – по подавлению окисления молибдата перекисью водорода (Чевари С.И. и др., 1991); глутатионпероксидазы – по убыли восстановленного глутатиона при его окислении гидроперекисью третбутила (Моин В.М., 1986). Концентрацию в сыворотке крови васкулярного эндотелиального фактора роста (vascular endothelial groth factor, VEGF) и большого эндотелина-1 1-38 определяли методом иммуноферментного анализа с реагентами и по протоколам процедур Сytimmune Sciences Inc. (США) и Biomedica Gruppe (Австрия) соответственно. Концентрацию эндотелиальных микрочастиц (ЭМ) определяли в бедной тромбоцитами плазме крови подсчетом СD31+ частиц размером 1,5-4,0 мкм методом проточной цитофлуорометрии с использованием мышиных моноклональных ФИТЦ-меченых антител фирмы Coltag (США) на цитофлуориметре «Epix XL» фирмы Coulter (Франция).

Для оценки проницаемости монослоя, образованного ЭМСЛЧ, применяли методику динамического измерения импеданса клеток (ECIS) (Giaever I., Keese C.R.,1988). Монослой клеток формировали на микроэлектродах (Applied Biophysics, США), через которые пропускали переменный ток силой менее одного микроампера. Электролитом служила стандартная среда для эндотелиальных клеток. Регистрировали суммарный импеданс в системе электродов, изменения которого отражали изменения в межклеточных и адгезионных (с поверхностью микроэлектродов) контактах. Выраженность окислительного стресса в культуре ЭМСЛЧ оценивали по концентрации ТБРП в лизате эндотелиоцитов и усилению флуоресценции клеток, предварительно обработанных дихлорфлюоресцином, с использованием микроскопа Nikon Eclipse TE 300. Количественный анализ изображений проводили с использованием программы Scion Image. Измерение концентрации VEGF в клеточной среде проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы и по протоколам процедур фирмы Santa Cruse Ltd. (США). Содержание HIF-1α и HIF-2α в лизате ЭМСЛЧ проводили методом иммуноблота в 7,5% полиакриламидном геле с использованием первичных мышиных моноклональных антител (Novus, США) к HIF-1α и HIF-2α и вторичных меченых пероксидазой хрена моноклональных антител (Chemicon Inc., США).

Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием программы Sigma Stat 3.1. (Systat Software Inc., 2004). Соответствие нормальному распределению оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. При проверке нормальности распределения не было выявлено различий между мужчинами и женщинами по использованным в работе показателям, поэтому анализ проводили без разделения участников исследования по полу. Для анализа выборок с нормальным распределением были избраны параметрические методы статистики. Межгрупповую вариабельность оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа; множественные парные сравнения по критерию Стьюдента-Ньюмена-Кейлса с использованием пакета ANOVA. Анализ данных, не соответствующих нормальному распределению, проводили с использованием критерия Уилкоксона. Сравнение долей проводили с использованием критерия χ2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей. В исследованиях, проведенных с участием здоровых добровольцев, в ответ на ПНГ были выявлены изменения микроциркуляторного русла и гемодинамических показателей, которые указывали на участие системы кровообращения в комплексной реакции организма на это воздействие. Во время четвертого (пятого) сеанса ПНГ зарегистрировано повышение систолического АД от 122,3±4,7 до 127,8±7,2 мм рт. ст. (p<0,05) и ЧСС от 68,7±4,8 до 76,9±5,6 уд/мин (p<0,05). Эти изменения ограничивались временем сеанса и выявлялись не более, чем в пяти последующих сеансах. Значимых изменений диастолического АД в отдельных сеансах не выявлено, наблюдалось тенденция к его снижению (р<0,2) через 15 минут после последнего сеанса ПНГ относительно исходного уровня, что согласуется с данными других авторов (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Горанчук В.В. и др., 2003). Изменения АД и ЧСС не выходили за пределы физиологической нормы, и, вероятно, отражали процесс формирования адаптации к повторяющимся гипоксическим стимулам. Через сутки после последнего сеанса не выявлено изменений АД и ЧСС относительно их уровня до курса ПНГ.

После курса ПНГ по данным конъюктивальной биомикроскопии в микроциркуляторном русле происходило выравнивание калибра сосудов, увеличение артериоло-венулярного соотношения и уменьшение встречаемости зон запустевания капилляров и, как следствие, снижение конъюнктивального индекса с 2,0±0,1 до 1,3±0,1 баллов (p<0,001).

Функциональные и морфологические изменения в кровеносной системе участников исследования, а также данные литературы об изменении продукции эндотелиальных факторов — васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), простагландинов, эндотелинов, оксид азота и других, при воздействии постоянной гипоксии (Minchenko A. et al., 1994; Liu Y. et al., 1995; Ni Z., 1998; Fryer R.M. et al., 2002; Semenza G.L., 2005), позволяли предполагать участие эндотелия в механизмах ответа на ПНГ. Для проверки этой гипотезы в плазме крови участников исследования была измерен уровень эндотелиальных факторов – большого ЭТ-1 1-38 и CD31+ эндотелиальные микрочастицы (ЭМ), а также VEGF, которые в настоящее время рассматриваются как маркеры активации/повреждения эндотелиоцитов и регенерации эндотелия соответственно (Zachary I et al., 2000; Chong A.-Y. et al., 2003; Horstman L.L. et al., 2004; Marti H.H., 2005).

Рис. 1. Изменения маркеров повреждения и регенерации эндотелия у здоровых людей под воздействием курса прерывистой нормбарической гипоксии (M ± SD). р – уровень значимости различий по сравнению с результатами до курса ПНГ по критерию Ньюмена-Кейлса.

В первый день после курса ПНГ наблюдалось увеличение содержания ЭМ и большого ЭТ-1 1-38 в плазме крови участников исследования (рис. 1). Эти данные согласуются с данными об умеренном транзиторном повреждении неэндотелиальных клеток при интермиттирующей гипоксии (Prabhakar N., 2001). Нельзя исключить, что повышение плазменного уровня ЭМ связано с усилением их образования при так называемой активации эндотелиоцитов, которая рассматривается как адаптивная реакция этих клеток на возмущающие факторы и проявляется комплексом фенотипических изменений в отсутствии морфологических признаков повреждения (Zwaal R.F. et al, 1997; Sabatier F. et al., 2002). Содержание как ЭМ, так и большого ЭТ-1 1-38 снижалось до исходного уровня ко второму дню после завершения курса ПНГ.

Повышение концентрации VEGF в первые сутки после курса ПНГ сменялось снижением ко вторым суткам, после чего на четвертые сутки отмечалось повторное возрастание (см. рис. 1). Снижение концентрации VEGF до исходных значений происходило к 14-м суткам после курса ПНГ. Две фазы ответа, вероятно, обусловлены разными механизмами, последовательно сменяющими друг друга: первый пик может быть следствием транзиторного слабовыраженного повреждения эндотелиоцитов активными формами кислорода (АФК) (Tsai W.C. et al., 2005), тогда как второй развивается вследствие усиления биосинтеза VEGF в ответ на это повреждение (Minchenko A. et al., 1994; Liu Y. et al., 1995; Sodhi A. et al., 2000).

Следует отметить, что выявленные после курса ПНГ изменения в плазменной концентрации эндотелиальных факторов у здоровых людей согласуются с данными об ослаблении повреждение эндотелия у больных эссенциальной артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца после воздействия ПНГ (Смагина И.В., 2002; Золовкина А.Г. и др., 2008).

Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели метаболизма активных форм кислорода у здоровых людей. Многочисленные данные об усилении продукции АФК различными типами клеток при действии гипоксического стимула (Леденев А.Н. и др., 1985; Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Yang W. et al., 1995; Pearlstein D.P. et al., 2002; Schumacker P., 2006) позволяли предполагать, что одним из повреждающих и/или активирующих эндотелиоциты факторов при действии ПНГ являются АФК.

В первый день после курса ПНГ, когда выявляется краткосрочная реакция на последний сеанс курса ПНГ, в сыворотке крови участников исследования были повышены общая прооксидантная активность (ОПА) и концентрация ТБРП относительно соответствующих значений этих показателей до курса ПНГ (табл. 1). В последующие дни наблюдалось снижение этих показателей окислительного метаболизма до уровня, соответствующего исходному состоянию.

Таблица 1

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на показатели оксидантного статуса здоровых людей (M ± SD)

Показатель

До ПНГ

(n=30)

После ПНГ

Первый день

(n=30)

Четвертый день (n=30)

Четырнадцатый день (n=30)

Общая прооксидантная активность, %

13,3 ± 1,4

27,2 ± 2,6

p< 0,001

17,1 ± 2,1

14,4 ± 1,7

Тиобарбитурат-реактивные продукты, мкМ

3,7 ± 0,2

7,6 ± 0,4

p< 0,001

4,1 ± 0,3

3,8 ± 0,2

Супероксид-дисмутаза, ед/мг Hb

78,0 ± 4,3

68,8 ± 3,3

p < 0,001

101,4 ± 5,2

p < 0,001

80,2 ± 3,9

Глутатион-пероксидаза, ед/г Hb

1910,0 ± 46,1

1185,9 ± 52,6

p< 0,001

2293,2 ± 49,0

p< 0,001

1886,4 ± 50,7

Каталаза, ед/г Hb

248,0 ± 11,2

198,6 ± 14,1

p < 0,001

382,7 ± 15,8

p< 0,001

293,3 ± 12,8

Примечание. р — уровень значимости различий по сравнению с результатами до курса ПНГ по критерию Ньюмена-Кейлса

Таким образом, весьма вероятно, что выявленное нами увеличение концентрации ЭМ и большого ЭТ-1 1-38 в плазме крови в значительной степени обусловлено повреждением/активацией эндотелиоцитов АФК и свободно-радикальными метаболитами процесса перекисного окисления липидов. Это согласуется с данными наших коллег о развитии умеренного транзиторного окислительного стресса, сопровождавшегося повышением концентрации комплекса маркеров повреждения эндотелиоцитов, у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями при действии ПНГ (Смагина И.В., 2002; Ельчанинова С.А. и др., 2004).

Можно полагать, что в механизм усиления продукции АФК при ПНГ вовлечены вызванный изменением парциального давления кислорода переход электронов с I и III комплексов дыхательной цепи на кислород и активация НАДФ-оксидазы (Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Лукьянова Л.Д., 2008; Schumacker P., 2006; Rathore R. et al., 2008).

Одновременно с изменениями в оксидантном статусе участников исследования под воздействием ПНГ регистрировалось транзиторное снижение активности всех трех исследованных антиоксидантных ферментов в первый день с последующим возрастанием после курса ПНГ. Снижение активности могли быть связаны с возрастанием функциональной нагрузки на ферменты и их инактивацией АФК, свободно-радикальными метаболитами в условиях нарастания выраженности окислительного стресса (Сазонтова Т.Г. и др., 2002; Comhair C.C.C. et al, 2005). Возрастание активности ферментов может объясняться как ослаблением этого инактивирующего эффекта, так и усилением экспрессии генов антиоксидантных ферментов. На возможность последнего механизма указывают данные экспериментальных исследований в культуре клеток и на животных в которых показано накопление мРНК антиоксидантных ферментов и увеличение их активности под воздействием гипоксии (Franco A.A. et al., 1999; Stroev S.A. et al., 2005).

Функциональные и биохимические признаки ответа эндотелиоцитов на ПНГ у здоровых людей позволяли предположить, что, механизм этого воздействия на сердечно-сосудистую систему включает прямые эффекты гипоксии на эндотелий. Для проверки этой гипотезы были проведены исследования в культуре эндотелиальных клеток микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ).

Исследование изменений показателей межклеточных контактов в культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии. Известно, что выполнение эндотелием таких функций как взаимодействие с клетками крови, регуляция тонуса сосудистой стенки, активности систем гемостаза и других зависит от состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов (Killy D.G. et al., 1996; Gregg D. et al., 2004; Garrido-Urbani S. et al., 2008). Типовой реакцией эндотелиоцитов в ответ на воздействие постоянной гипоксии и других активирующих факторов является изменение межклеточных и адгезионных контактов (Usatyuk P.V., Natarajan V., 2005; Dehler M. et al., 2006). Согласно данным Partridge C. (1995), непрерывная гипоксия вызывает связанное с перестройкой межклеточных контактов изменение проницаемости монослоя эндотелиоцитов, зависящее от продолжительности и степени ограничения доступа кислорода к клеткам. В связи с этим, нами была проведена оценка состояния межклеточных контактов в культуре ЭМСЛЧ методикой ECIS (Electric Cell–substrate Impedance Sensing) по изменению импеданса монослоя клеток (Giaver I., Keese C.R., 1991). Дополнительно состояние межклеточных контактов оценивали методом световой микроскопии нативной культуры.

После первого сеанса ПНГ было выявлено снижение импеданса монослоя культуры ЭМСЛЧ примерно на 15% от исходного уровня (рис. 2А), что указывало на возрастание проницаемости монослоя клеток. Уже через 20 минут после прекращения сеанса прерывистой гипоксии обнаруживалось полное восстановление проницаемости до исходного уровня. При первом сеансе ПНГ была выявлена также дезинтеграция клеток и изменение их морфологии — эндотелиоциты принимали вытянутые, веретенообразные формы (рис. 2Б). Последнее, вероятно, связано не только с изменением структуры межклеточных контактов, но и перераспределением в клетках элементов цитоскелета, в частности, полимеризацией актина и образованием стресс-фибрилл, характерных при воздействии гипоксии (Usatyuk P.V., 2005; Ghassemifar R. et al., 2006).

А)

Б)

Рис. 2. Влияние сеансов прерывистой нормобарической гипоксии на проницаемость и структуру монослоя клеток в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека (M± SD), n=7

После второго сеанса ПНГ достоверного снижения импеданса ЭМСЛЧ не наблюдалось. Третий сеанс ПНГ вызывал 12%-ное увеличение импеданса, которое сохранялось в течение 20 мин после сеанса. Световой микроскопией нативной культуры ЭМСЛЧ после второго и третьего сеансов ПНГ существенных морфологических изменений выявлено не было.

Принимая во внимание данные об участии АФК в регуляции прочности межклеточных контактов эндотелиоцитов (Krizbay I.A. et al., 2003; Usatyuk P.V., Natarajan V., 2005), можно предполагать, что появление такой резистентности культуры эндотелиоцитов к повторным воздействиям ПНГ может быть связана со снижением выраженности индуцированного гипоксией окислительного стресса и ослаблением влияния АФК на белки межклеточных контактов.

Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов. Была проведена оценка окислительного стресса в культуре ЭМСЛЧ по уровню ТБРП в лизате эндотелиоцитов, а также накоплению АФК методом флуоресцентной микроскопии. После первого и второго сеансов ПНГ было обнаружено практически двукратное усиление генерации АФК в эндотелиоцитах и, одновременно с этим, повышение концентрации ТБРП в лизате эндотелиоцитов (табл. 2). После третьего сеанса ПНГ уровень этих показателей снижался до исходных значений, отражая, вероятно, процесс приспособления эндотелиоцитов к прерывистой гипоксии.

Таблица 2

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека (M ± SD)

Показатели

До ПНГ

(n=5)

После первого сеанса ПНГ (n=5)

После второго сеанса ПНГ (n=5)

После третьего сеанса ПНГ (n=5)

Продукция

АФК, %

Флуоресцент-ная микроскопия ЭМСЛЧ с ДАДХФ

97,6 ± 14,3

142,9 ± 30,1



Страницы: 1 | 2 | Весь текст